男性不育正在从个人问题转变为公共健康问题。这是因为大约15%处于生殖年龄的夫妇不育,而男性不育约占这种不育的50%。在男性生殖系统中,输出小管通过液体重吸收和维持水和离子代谢的稳态,在精子运输和成熟过程中发挥着重要作用。然而,输出小管液体重吸收能力的功能障碍,会导致导管阻塞和精子异常,致使人类和其他哺乳动物雄性生育障碍。ADGRG2(adhesion G-protein coupled receptor G2,粘附 G 蛋白偶联受体 G2)的基因突变,导致在输出小管中液体重吸收异常,造成男性不育症,这表明该细胞表面受体在调节液体重吸收的过程中有重要作用。然而,ADGRG2如何调控输出小管中水-离子代谢的稳态和液体重吸收的分子机制仍不清楚。ADGRG2 属于 7 次跨膜 G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)超家族,GPCRs调节了大约80%的跨膜信号转导。不同类型的G蛋白和arrestins作为这些GPCRs下游的信号中心枢纽,调节GPCRs的大部分功能。在输出小管中,G蛋白和它们的平行信号分子arrestins如何调节输出小管液体重吸收和男性的生育能力仍然不清楚。一、研究目的:1.ADGRG2如何通过调控其下游的目标分子调节输出小管中水-离子代谢的稳态和液体的重吸收;2.在输出小管中,ADGRG2下游的G蛋白亚型如何调控输出小管的液体重吸收和男性的生育能力;3.在输出小管中,p-arrestins在调节输出小管液体重吸收和男性的生育能力方面的作用;4.ADGRG2胞内环的特定氨基酸残基对ADGRG2与G蛋白亚型偶联的影响及对输出小管液体重吸收和男性生育能力的影响;5.在Adgrg2-/Y小鼠中的条件表达野生型ADGRG2能否挽救Adgrg2-Y小鼠生殖缺陷表型。二、研究方法主要的研究方法简述如下:1.附睾和输出小管膜成分的制备用于Western blot和免疫共沉淀的检测;2.输出小管的分离和结扎用于检测在不同的实验条件下,输出小管直径的变化;3.重组腺病毒和慢病毒的构建,用于小鼠的在体感染或者分离输出小管组织的感染;4.利用pH值敏感的荧光探针carboxy-SNARF(?)-1测量细胞内的pH值;5.实时定量PCR(qRT-PCR)检测组织和细胞中G蛋白,p-arrestins和渗透性驱动因子的mRNA转录;6.免疫荧光染色检测输出小管中各种相关蛋白的表达及定位情况;7.小鼠附睾输出小管上皮细胞培养,用于qRT-PCR分析和电生理的相关实验;8.免疫共沉淀检测输出小管中相关蛋白和蛋白之间的相互作用;9.全细胞膜片钳记录用于分离的输出小管上皮细胞和体外转染的HEK293细胞的电生理检测;10.cAMP和IP1 ELISA检测组织中cAMP和IP1的水平;11.GloSensor cAMP 检测 HEK293 细胞中 cAMP 水平;12.NFAT双荧光素酶报告系统分析HEK293细胞中Ca2+水平;13.组织HE染色,检测相关的形态学指标;14.用CFTR siRNAdicer处理小鼠输出小管用于检测CFTR敲低对非纤毛细胞的影响;15.统计学分析:所有的数据均以均值±标准差的形式显示,统计学比较采用带有ANOVA的GraphPad Prism5软件,p<0.05为差异有显著性。三、结果1.Gq活性是输出小管液体重吸收和男性生育力所必需的ADGRG2在输出小管的没有乙酰化微管蛋白染色的细胞中定位,表明它在非纤毛细胞中特异表达。非纤毛细胞的Golf、Gi2、Gq、G11和G13表达水平高于脑组织,而Gs、G12和Gz的表达水平则和脑组织的表达水平相似。使用特定的药物干预和敲除模型研究不同的G蛋白亚型信号通路在输出小管中液体重吸收的作用。野生型(WT)小鼠由于输出小管腔内液体的正常吸收而没有显示出管腔直径的改变,但是从Adgrg2-/Y小鼠中得到的结扎输出小管在72 h的体外培养后,输出小管腔的直径增加了40%。相应的,应用Gq蛋白水平降低50%的Gnaq+/-小鼠或蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220,显著地削弱了输出小管的液体重吸收,这模仿了从Adgrg2-/Y小鼠中获得的输出小管表型,这表明Gq-PKC信号对于有效的液体重吸收是必需的。与WT小鼠相比,Gnaq+/-小鼠的输出小管始终表现为梗阻性精子的积累,而Gnaq+/-小鼠的附睾起始部和附睾头部区域内的空腔显示精子水平的下降。与同窝的WT小鼠相比,从Gnaq+/-小鼠附睾尾部获取的精子数和Gnaq+/-小鼠的出生率都显著下降。这些数据表明,在不同的G蛋白亚型中,Gq的活性对于输出小管进行液体重吸收和男性生育能力是必需的。2.输出小管中ADGRG2和CFTR偶联及其在输出小管液体重吸收中的作用我们检测了液体分泌和吸收的潜在渗透性驱动因子在输出小管和ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中的表达水平。其中,NKCC、DRA、CFTR、SLC26a9、NHE3和Cavl.3在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中有较高的表达。接下来使用一系列药理学阻滞剂来检测这些膜蛋白功能的不适当调控是否参与了输出小管中由ADGRG2或Gq介导的液体重吸收。在应用GlyH-101或CFTRinh-172阻断CFTR活性对输出小管内的液体重吸收有显著影响,并复制了Adgrg2-/Y小鼠的表型。因ADGRG2的失活和在WT小鼠中应用CFTR通道阻滞剂引起的表型提示CFTR和ADGRG2在输出小管液体重吸收的调节过程中可能有功能联系。CFTR是生殖和肾脏系统中pH平衡和氯离子的关键调节子,在液体的重吸收中具有重要作用。/Adgrg2-/Y小鼠的pH值稳态受损,输出小管内溶液的pH值为7.6,而同窝的WT小鼠的pH值为7.2。此外,CFTR抑制剂CF-TRinh-172的应用使WT小鼠的输出小管的pH值增加了约0.3,但对Adgrg2-/Y小鼠的pH值没有显著影响,提示Adgrg2-/Y小鼠的CFTR功能障碍影响pH稳态。特别地,ADGRG2和CFTR在输出小管非纤毛细胞的结构顶膜上有明确的共定位,同时ADGRG2与CFTR具有免疫沉淀相关性。以上这些结果表明在输出小管非纤毛细胞中ADGRG2和CFTR能够形成复合物并且能够功能偶联。3.ADGRG2启动子-RFP标记的输出小管非纤毛细胞的全细胞Cl-电流然后,我们记录了来自WT和Adgrg2-/Y小鼠中由ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流。从WT小鼠中提取的ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞的膜片钳记录显示一个可逆的全细胞Cl-电流,这在外液用葡萄糖酸盐(gluconate,Gluc-)取代时显著降低。这种全细胞Cl-电流在用Cl溶液代替后恢复。相比之下,Adgrg2-/Y小鼠的全细胞Cl电流显著低于其同窝WT小鼠的全细胞Cl电流,在使用含Gluc-的洗液替代Cl溶液后的反应没有明显的变化。这些结果提示,在输出小管内ADGRG2缺失显著降低了 ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞的全细胞Cl电流。4.CFTR介导了 ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流接下来,我们研究了不同的Cl通道和转运蛋白抑制剂对从Adgrg2-/Y小鼠和同窝的WT小鼠中获得的非纤毛细胞全细胞Cl电流的影响。特异性CFTR抑制剂CFTRinh-172显著降低了全细胞Cl-电流电流。此外,应用CFTRinh-172可消除Adgrg2-/Y小鼠与同窝的WT小鼠之间全细胞Cl-电流的差异。当我们在输出小管中降低CFTR的表达,WT小鼠的全细胞Cl-电流显著降低。这些结果表明,CFTR在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中被激活,这些细胞介导了外向全细胞Cl-电流,而ADGRG2则是CFTR在这些细胞中激活的基本的必要条件。5.在输出小管中,Gq活性对于ADGRG2/CFTR的偶联是必需的与Adgrg2-/Y小鼠相似,从Gnaq+/-小鼠中得到的输出小管在pH稳态中表现出不平衡。同样的,我们观察到在Gnaq+/-小鼠中ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流比同窝的WT小鼠中所观察到的显著降低。Gq下游效应器PKC抑制剂Ro 31-8220的应用进一步抑制了全细胞Cl-电流。这些结果表明,Gq-PKC信号通路在输出小管中对基础的CFTR激活起关键作用,它控制Cl-和pH稳态从而进行有效的液体重吸收。接下来我们研究了 CFTR功能是否需要ADGRG2对Gq的激活。在输出小管中,Gq位于ADGRG2表达的细胞中。同时,Gq在ADGRG2抗体免疫沉淀复合物中很容易被检测到,这表明,在输出小管中,ADGRG2与Gq之间有物理相互作用。此外,从Adgrg2-/Y小鼠中获得的结扎输出小管的内源性游离态IP1和cAMP水平显著低于其同窝WT小鼠。综上所述,这些数据表明Gq通过介导ADGRG2/CFTR偶联调节输出小管的液体重吸收,Gq-IP3-PKC通路在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中被激活。6.由p-arrestin-1而不是p-arrestin-2介导的ADGRG2/CFTR复合物的形成在输出小管的液体重吸收过程中至关重要我们研究了Arrb1-/-和Arrb2-/-小鼠输出小管的液体重吸收,与同窝的WT小鼠相比,Arrb2-/-小鼠的输出小管表现出正常的液体吸收和pH值稳态,而从Arrb1-/-小鼠中获得的输出小管的功能明显受损。此外,Arrb2-/-或WT小鼠的ADGRG2和CFTR在非纤毛细胞的结构顶膜区共同定位,而在Arrb1-/-小鼠中则表现为分离。在p-arrestin-1缺失的输出小管,CFTR的定位远离Ezrin表明β-arrestin-1对于CFTR的正确定位是必需的。同样的,在WT和Arrb2-/-小鼠中CFTR能够和ADGRG2免疫共沉淀,而源自Arrb1-/-小鼠的输出小管ADGRG2-免疫沉淀复合物中没有发现CFTR和ADGRG2的相互作用,进一步表明在输出小管中β-arrestin-1在包含ADGRG2和CFTR信号复合体中是一个重要的组件。7.ADGRG2与G蛋白亚型偶联的分子决定簇及其在体外实验中对CFTR活性的调节在体外,ADGRG2的过表达导致了其组成性Gs和Gq偶联活性。进行全细胞膜片钳记录以检测ADGRG2和CFTR共表达后对膜电流的影响。ADGRG2和CFTR的共表达显著增加了电流响应的幅度和倾角,与仅用CFTR进行转染的细胞相比,CFTR抑制剂CFTRinh-172显著降低了电流响应的幅度和倾角,表明CFTR通道在重组系统中被ADGRG2激活。重要的是,PKC抑制剂Ro 31-8220显著降低了 ADGRG2诱导的CFTR活性。综上所述,ADGRG2通过激活Gq-PLC-PKC信号通路,增加CFTR的Cl-电流。我们选择了 ADGRG2胞内环2和3中的一些突变,然后用全细胞膜片钳技术检测这些ADGRG2突变体与CFTR偶联的活性。尽管Gs信号缺陷的突变体显示ADGRG2与CFTR的偶联降低,Gq信号缺失突变体和Gs/Gq双信号缺陷突变体H696A/M697A则使ADGRG2与CFTR之间的偶联消失。这表明,ADGRG2胞内环2和3中的特定氨基酸残基是ADGRG2的G蛋白亚型偶联的决定因素。此外,在体外重组系统中,ADGRG2下游的Gq信号是CFTR激活的关键。8.野生型ADGRG2或其选择性G蛋白亚型信号突变体的条件表达对Adgrg2-/Y小鼠生殖缺陷表型挽救的影响。接下来,我们研究了 ADGRG2/G蛋白亚型的相互作用如何作用于由ADGRG2缺失导致的男性不育症。与WT小鼠相比,Adgrg2-/Y小鼠的输出小管常表现为梗阻性精子积累,附睾尾部的精子数量明显减少,并出现形态异常的精子。在Adgrg2-/Y小鼠中,非纤毛细胞ADGRG2-WT的条件表达显著降低了梗阻性精子积累,使尾附睾的精子数恢复一半以上,而ADGRG2的G蛋白信号缺失突变体的表达,尤其是Gs/Gq双信号缺失突变体ADGRG2-HM696AA或Gq信号缺失突变体Y708A和RK803EE的条件表达显著降低了这一效果。为了研究上述有关精子的表型是否与输出小管液体重吸收有关,我们用ADGRG2-WT或G蛋白信号缺失突变体病毒感染后的输出小管分离培养,并测量结扎后的腔体直径。有趣的是,Gs缺失突变体Y698A和F705A的条件表达略微降低了Adgrg2-/Y 鼠的输出小管的膨胀,而Gq信号突变体对Adgrg2-/Y小鼠输出小管腔体的直径没有显著的影响。综上所述,在体内表型挽救实验中,在ADGRG2的下游Gq活性对于输出小管的液体的重吸收和精子的运输是尤为重要的。四、结论1.Gq活性是输出小管液体吸收和男性生育力所必需的。2.输出小管中的ADGRG2和CFTR偶联对输出小管的液体重吸收是必需的。3.CFTR介导了输出小管非纤毛细胞的全细胞Cl-电流。4.在输出小管中,Gq活性对于ADGRG2/CFTR的偶联是必需的。5.由p-arrestin-1而不是p-arrestin-2介导的ADGRG2/CFTR复合物的形成在输出小管的液体重吸收过程中至关重要。6.ADGRG2胞内环2和3中的特定氨基酸残基是ADGRG2与G蛋白亚型偶联的决定因素;Gq信号缺失突变体和Gs/Gq双信号缺陷突变体则使ADGRG2与CFTR之间的偶联消失。7.野生型ADGRG2在Adgrg2-/Y小鼠中的条件表达能够挽救Adgrg2-/Y小鼠生殖缺陷表型,而Gq信号缺失突变体没有挽救效果。