石斛属(Dendrobium Sw.)隶属兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendroideae)石斛亚族(Dendrobiinae),是兰科的第二大属,全球超过1400个物种。Lindley最初在1844年将石斛属划分为4个组,到了 1912年Schlechter共设定了 41个组,中国有14个组。石斛属的分组情况比较复杂,在系统发生研究中,大多数的组都被证实是多源的,其中,顶叶组(Sect.Densiflora)石斛的关系最为复杂,有些物种的分类地位尚不明确,因此很有必要对中国顶叶组石斛开展系统发生分析的研究。本研究基于nrDNA ITS及cp DNA序列,采用贝叶斯法分别构建了50种石斛属植物的系统发生树,通过探讨其属下组别间的亲缘关系,进而揭示中国石斛属顶叶组的分类学地位。结果显示:中国顶叶组石斛是多源的,顶叶组的物种被划分为两大部分位于不同的分支;其中鼓槌石斛、长苏石斛和苏瓣石斛内嵌在寡花组中,处于一个分支上,且具有较高的分支支持率(后验概率值0.86);在另一个分支中的聚石斛和小黄花石斛形成单独的一个亚分支(后验概率值1.00);球花石斛、密花石斛、四角石斛和具槽石斛这四个物种形成另一个亚分支(后验概率值1)。我们的研究结果支持将聚石斛和小黄花石斛独立成一个组。本研究分子证据表明鼓槌石斛、苏瓣石斛和长苏石斛应划入寡花组。球花石斛(Dendrobium thyrsiflorum Rchb.)与密花石解(Dendrobium densiflorumLindl.)同属于中国顶叶组植物,它们的茎端可以加工成一种重要的传统中药“黄草石斛”,它们同时也是商品黄草石斛药材重要的基源植物。然而球花石斛与密花石斛的化学有效成分不同,其功效也不一致。对于黄草类石斛来说,在无花、无叶的鲜品状态下,依靠经典的鉴定方法难以准确进行种间鉴别,尤其是球花石斛与密花石斛,它们是《中国植物志》中记载的易混淆种。为了准确地鉴别出球花石斛与密花石斛,本实验开展了相关的研究。本研究对球花石斛与密花石斛的nrDNA ITS序列进行分析,结果显示球花石斛与密花石斛有一种共享的nrDNA ITS核型,仅通过nrDNA ITS序列无法准确鉴别;基于叶绿体基因片段psbA-trnH、rpsl 5-ycf1、psbB-clpP、rpl32-trnL、atpH-atpI、psbK-psbI、accD-psaI,通过建树法,对球花石解和密花石斛进行鉴定。单个的cpDNA片段构树均不能区分球花石斛与密花石斛;通过计算球花石斛和密花石斛的种内及种间的K2P遗传距离发现atpH-atpI、psbK-psbI和rps15-ycf1这3个片段的种间变异大于种内变异,利用这3个片段任意组合构建系统树,球花石斛都能聚成一个单系群,从而与密花石斛相区分。基于cpDNA序列的比对结果,本研究利用rps15-ycf1序列设计了特异性的荧光引物对(R15/Y1),建立了一个基于SYBRGreen Ⅱ的荧光定量PCR球花石斛鉴别体系。本研究利用该引物进行荧光定量PCR扩增,结果显示球花石斛Ct值区间为[13.83,15.9],近缘物种Ct值区间为[29.22,37.01],两者具有显著性差异,可以快速准确地鉴别出球花石斛。这也为石斛的近缘物种鉴别提供了新的思路。