纺锤链霉菌(Streptomyce netropsis) SD-07系本实验室2007年于山东省济南市南部山区分离得到,能产生广谱高效的多烯大环内酯类抗真菌抗生素。其中,五烯大环内酯含量最高,七烯大环内酯次之,还包含极少量的四烯大环内酯和／或六烯大环内酯,其中有些具有新的化学分子式。因其抗菌活性远高于目前临床上广泛使用的多烯大环内酯类抗真菌抗生素(两性霉素B),有进一步研发成国家一类新药的潜力(新型抗真菌抗生素)。为研究其抗生素产生基因簇及相关的调控基因的功能,有必要获得抗生素合成基因簇的核酸序列等相关信息,以及建立其遗传操作体系。因此,本文工作包括以下3部分：1.完成了全基因组的扫描测序,并对抗生素合成基因簇进行了初步分析。得到的基因序列全长7685111bp,384个scaffold, G+C含量为71.7%。利用基因预测软件和NCBI在线序列比对,完成了对orf的注释,共得到60个包含抗生素合成相关基因的orf,定位在37个scaffold上。利用模块型PKS(polyketide synthases)分析系统数据库ASMPKS对预测所得到的PKS序列中包含的模块及可能合成的产物进行了预测,这些orf共包含32个酮基合成酶(KS, ketosynthase)结构域,27个酰基转移酶(AT, acyl transferase)结构域,42个酰基载体蛋白(ACP, acyl carrier protein)结构域,12个脱氢酶(DH,dehydratase)结构域,24个酮基还原酶(KR, ketoreductase)结构域,4个烯基还原酶(ER, enoyl reductase)结构域和2个硫酯酶(TE, thioesterase)结构域。这为研究纺锤链霉菌SD-07菌株的多烯大环内酯类抗生素合成基因簇及其调控序列的功能提供了基本数据。但是,全基因组的扫描测序结果没有给出多烯大环内酯类抗生素合成基因簇的完整序列。2.建立了抗生素合成基因簇的亚克隆文库。建立抗生素合成基因簇的亚克隆文库,不仅可以用来测序以获得抗生素合成基因簇的完整序列,还可以用于今后抗生素合成基因表达调控研究。本文利用质粒pJTU2554建立了S.netropsis SD-07的fosmid基因组文库,得到并保存了2304个克隆子。其中,每个克隆子包含外源DNA片段的长度约为34kb。以SD-07基因组为8×106bp计,此基因文库的覆盖率为：99.45%。随后,利用多烯类抗生素聚酮合酶PKS同源序列设计的两组DNA探针：KS-AT和DH-KR,通过两轮Southern杂交从上述2304个克隆子中筛选出含有KS-AT或DH-KR同源基因的克隆子101个。这101个克隆子经KS序列引物PCR扩增验证全部为阳性,表明这些克隆子都至少包含1个抗生素合成基因。因此,它们组成了包含抗生素合成基因簇的亚克隆文库,经计算此文库的覆盖率为99.9%。为今后获得抗生素合成基因簇的完整核酸序列、以及研究抗生素合成基因的表达调控等打下了基础。3.成功建立了纺锤链霉菌SD-07菌株的遗传操作系统。尽管链霉菌的遗传转移体系早已建立,包括接合转移,原生质体转化和电转化三种方法。但至今国内外仍没有关于纺锤链霉菌遗传转移体系的成功报道。本文首次建立了纺锤链霉菌SD-07接合转移体系。用于接合转移的质粒为整合型质粒pSET152,从甲基化修饰缺陷的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)成功转移到纺锤链霉菌SD-07中并稳定整合在染色体上。优化了纺锤链霉菌SD-07接合转移的主要影响因素,使接合频率提高了近万倍。结果显示：纺锤链霉菌SD-07接合转移体系的最佳条件为：供体菌／受体菌比例为1/1(108：108),孢子热激条件为45℃,10min或者15min,孢子萌发时间为6h,接合转移培养基为GSY(含60mM CaCl2和60mM MgCl2),抗生素覆盖时间为16-20h,萘啶酮酸45μg/ml,阿伯拉霉素为30μg/ml,最高接合频率约为6×10-4/受体细胞。发现了影响接合转移频率的新因素。Ca2+的加入及其浓度是影响接合转移效率的最重要因素。Ca2+比Mg2+更能提高接合频率,两者相差10-100倍。60mM CaCl2,60mM MgCl2是提高接合频率的最佳组合。其次,发现接合转移培养基中有机氮源含量是影响接合频率的另一重要因素。以上两点的影响作用比以前报道的其它因素的影响作用更大,如供受体比例,热激条件、孢子萌发时间、抗生素覆盖时间等。随后我们还尝试利用更加快捷的电转化方法建立纺锤链霉菌SD-07的遗传操作系统。对电击条件与存活率之间的关系、受体细胞的预处理条件(溶菌酶处理)等进行了探索。尽管目前没有最终完成,但是目前所得到的实验结果和数据及其所反映的规律,为之后的研究打下了基础。