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沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌均是鸡主要垂直传播细菌病的病原。为了更好的对三种疾病致病原进行鉴别诊断,本研究对三种病原菌进行分离培养和鉴定,单一荧光定量PCR检测方法以及多重荧光定量PCR检测方法的研究,并组装了检测试剂盒,旨在为沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌的鉴别诊断提供一种简单、用时少、敏感、特异的检测试剂盒。1.经培养分离获得沙门氏菌流行菌株。分离菌株16 S rRNA部分碱基序列之间同源性为99.7%,与GenBank中AB594754、AB594759、AB594763、EU118085等肠道沙门氏菌处于同一个分支,同源性最高达99.8%。根据沙门氏菌invA基因设计引物,所建立的荧光定量PCR检测方法,对沙门氏菌的检测最低浓度可达10~1cfu/mL,敏感性比常规PCR方法高100倍,重复性试验的变异系数为3.74%和0.10%。2.经培养分离获得大肠杆菌流行菌株。分离菌株16 S rRNA部分碱基序列彼此之间序列同源性在99.3%~100%之间,与GenBank中AY098487(鸡源丹麦分离株)、NZ_CP015855(人源韩国分离株)、NZ_CP015995(鸡源中国分离株)的同源性均较高。根据大肠杆菌FimH基因设计引物,所建立的荧光定量PCR检测方法,对大肠杆菌的检测最低浓度10~1cfu/mL,敏感性比常规PCR方法高100倍,重复性试验的变异系数为0.91%和1.59%。3.经培养分离获得奇异变形杆菌流行菌株。分离16 S rRNA部分碱基序列彼此之间序列同源性为99.7%~100%,与AB272366(禽源鸡源日本分离株)处于同一个分支,同源性最高达100%。根据奇异变形杆菌ureR基因设计引物,所建立的荧光定量PCR方法,对奇异变形杆菌的检测最低限度可达10~1cfu/mL,敏感性比常规PCR方法高100倍,重复性试验的变异系数为2.23%和1.68%。4.建立了检测沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌的三重荧光定量PCR方法,该方法对沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌的检测最低限度均可10~1cfu/mL,重复性试验的变异系数均小于5%。5.将建立的沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌的三重荧光定量PCR方法组装了试剂盒,该试剂盒对于疑似样品的检出率达100%,试剂盒置于-20℃冰箱中避光保存6个月仍具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。