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腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)作为治疗终末期肾病的替代方法之一,当前已经被越来越广泛的运用于临床,腹膜纤维化(Peritional fibosis,PF)是导致患者腹膜透析治疗失败的主要原因,多种因素可导致PF,而腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是腹膜纤维化的一个关键因素。硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate,IS)作为内源性毒素,它与肾脏纤维化的关系已得到广泛认可。但目前国内外关于IS与腹膜透析的相关研究则较少,我们前期的研究发现,IS可诱导腹膜间皮细胞发生EMT,转化生长因子β1(transforming growth factor beta,TGF-β1)可能参与了细胞转分化的过程,但是IS是通过何种途径导致腹膜间皮细胞的EMT并不清楚。在EMT的发展过程中,Snail1是研究较多的可调控E-cadherin的转录因子,它可以抑制E-cadherin的表达,促进α-SMA的表达。那么IS是否能通过TGF-β1及Snail1的表达来促进腹膜间皮细胞的EMT尚不清楚。基于以上分析,本课题拟通过体外实验来研究TGF-β1及Snail1在IS诱导腹膜间皮细胞EMT中的作用机制。【目的】(1)通过细胞形态学以及α-SMA的表达明确IS能否促进PMC转分化。(2)研究IS对TGF-β1表达的促进作用以及使用TGF-β1受体抑制剂后细胞形态学改变及α-SMA的表达变化,明确TGF-β1在IS促进PMC转分化中的作用。(3)研究IS刺激PMC后及使用TGF-β1受体抑制剂后Snail1表达情况,推测其是否参与IS诱导的PMC发生EMT过程。【方法】1、体外培养人腹膜间皮细胞株(HMrSV5),进行复苏、传代。2、将细胞分为5个组:(1)对照组(RPMI1640+10%FBS培养基,培养过程中不干预)、(2)IS组(浓度1000umol/L的IS与RPMI1640+10%FBS培养基共培养)、(3)IS+LY组(含2umol/L LY364947+1000umol/LIS配制成的RPMI1640+10%FBS培养基共培养)、(4)PDF组(4.25%腹透液与RPMI1640+10%FBS培养基共培养)、(5)PDF+LY(LY364947+4.25%腹透液与RPMI1640+10%FBS培养基共培养);待细胞长至约70~80%汇合时进行干预,分别在细胞培养至0h、4h、24h、48h、72h观察各组细胞形态变化,并检测相关指标的表达。3、应用Western blot方法检测各组各时间点α-SMA的蛋白表达情况,qRTPCR检测各组各时间点TGF-β1及Snail1基因的相对表达量。【结果】(1)IS刺激PMC后,细胞由典型的鹅卵石、铺路石样逐渐变细变长,呈梭形状改变,并呈时间依赖性。(2)IS组刺激PMC后,α-SMA蛋白表达在72h最明显,TGF-β1受体抑制剂作用下,24h、48h、72h时间下α-SMA蛋白的表达较对照组显著减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)IS组刺激PMC后,TGF-β1的基因表达在48h增加最明显,TGF-β1受体抑制剂作用下,TGF-β1表达量总体不明显,48h后,TGF-β1表达较IS组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)IS组刺激PMC后,Snail1基因表达量在48h增加最明显,TGF-β1受体抑制剂作用下,Snail1表达量总体不明显,48h后,Snail1表达较IS组表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】1、IS刺激腹膜间皮细胞,可造成细胞发生形态学变化,符合EMT形态学特征,同时α-SMA的蛋白表达增高,进一步明确IS可诱导腹膜间皮细胞的转分化。2、IS诱导腹膜间皮细胞发生EMT的过程中,IS可促进TGF-β1的基因表达,而抑制TGF-β1可显著抑制IS刺激PMC后EMT形态变化和α-SMA的蛋白表达,表明TGF-β1参与了此EMT过程。3、IS诱导腹膜间皮细胞发生EMT的过程中,IS可促进Snail1的基因表达,而抑制TGF-β1的表达可抑制Snail1的基因表达,结合Snail1在细胞转分化中的作用,提示Snail1参与了IS诱导腹膜间皮细胞发生EMT过程。