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背景:目前已有多数研究发现在肝细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、骨癌等多种肿瘤组织中出现谷氨酰胺酶（GLS）的异常高表达,同时GLS可能参与这些肿瘤增殖和转移的调控,而GLS在胆管细胞癌（CCA）中是否存在表达异常及调控机制尚不明确。目的:我们通过公共数据库及转录组学、代谢组学、免疫荧光,初步探索GLS在CCA中的表达情况及其潜在的调控机制。方法:对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中胆管癌肿瘤及癌旁组织转录组学数据的差异性表达进行统计学分析,得到GLS在CCA肿瘤组织及癌旁组织的差异性表达及GLS与肿瘤免疫细胞、M2巨噬细胞及其表达基因（CD163、TGFB1等）、Wnt/β-catenin信号通路相关基因（WNT2、WNT3、CTNNB1等）、CCND1、MYC的相关性。同时我们收集了自2022年07月至2022年12月在南昌大学第二附属医院行胆管癌手术的CCA肿瘤组织及癌旁组织标本,采用转录组学及基因集富集分析得到GLS、M2巨噬细胞及其表达基因（CD163、TGFB1等）、Wnt/β-catenin信号通路相关基因（WNT2、WNT3、CTNNB1等）、CCND1、MYC等的m RNA表达结果;液相色谱-质谱仪（LC-MS）代谢组学检测肿瘤及瘤旁组织代谢物的差异性;通过转录组学及代谢组学联合分析探索GLS与转录组学、代谢组学及巨噬细胞的相关性;免疫荧光进一步验证差异表达的GLS与巨噬细胞亚型的相关性。回顾性分析并随访这些胆管癌患者的临床资料及数据。采用R语言、SPSS 26.0、Graphpad Prism 8软件进行统计学分析。结果:基于TCGA数据库转录组学数据分析可知,GLS在CCA肿瘤组织中高表达,在癌旁组织中低表达。且GLS基因与单核巨噬细胞、M2巨噬细胞及其表达基因CCL2、CD163、CHI3L1、TGFB1、TGM2、STAT6等呈正相关;GLS基因与Wnt/β-catenin信号通路相关基因,如WNT2、WNT3、WNT5A、WNT7B、WNT8B、WNT9A、CTNNB1等呈正相关;GLS基因也与CCA的癌基因CCND1、MYC呈正相关。进一步分析可知,WNT1、WNT2、WNT5A、WNT7A、WNT9B、WNT10B、CTNNB1等基因与CD163基因表达呈正相关;WNT2、WNT5A、WNT7A、WNT10A、WNT10B、CTNNB1与TGFB1基因表达呈正相关;WNT1、WNT4、WNT7A、WNT11、CTNNB1与MRC1基因呈正相关;WNT4、WNT7B与CCL2基因呈正相关;WNT2、WNT11与CHI3L1呈正相关;WNT3、WNT8B与STAT6呈正相关;WNT2、WNT7B、WNT9A与TGM2呈正相关。通过转录组学分析可知,肝内胆管细胞癌（intrahepatic Cholangiocarcinoma,i CCA）中肿瘤组织的总体基因表达量与癌旁组织存在一定的差异性（Pearson correlation=0.0894）,这些差异基因主要参与调节巨噬细胞分化、调节吞噬作用、脂肪及氨基酸代谢等刺激机体产生免疫反应、凝血反应、器官组织再生等生物学过程。进一步分析证实,GLS基因在CCA肿瘤组织中高表达,而在癌旁组织中低表达（P=0.0056）;在i CCA亚组中,GLS基因在i CCA肿瘤组织中高表达,而在癌旁组织中低表达（P=0.0164）;CCND1在i CCA肿瘤组织中呈现高表达（P=0.0485）,CD86在i CCA癌旁组织中高表达（P=0.0274）。通过代谢组学检测可知,CCA中肿瘤组织与癌旁组织的各项代谢物质含量存在明显差异性。虽然谷氨酰胺、α-酮戊二酸在CCA肿瘤组织及癌旁组织中并未得到统计学差异性,但可以看出,其在肿瘤组织中的含量相较于癌旁组织有更高的趋势。对14例CCA手术标本的转录组学与代谢组学共同分析可知,GLS基因与WNT2呈正相关（r=0.44,P=0.0334）、与WNT3呈正相关（r=0.59,P=0.00262）、与CTNNB1呈正相关(r=0.83,P=5.61*10-7)、与MYC呈正相关（r=0.69,P=0.000184）。通过CIBERSORT法说明GLS与M2巨噬细胞呈正相关（r=0.44,P=0.03）。通过免疫荧光结果证实,肿瘤组织的CD68+、CD86+、CD163+的总体表达量较对应的癌旁组织更高（P=0.0178）;CD68+在肿瘤组织的表达量较癌旁组织高（P=0.0495）;CD163＆CD68+在CCA肿瘤组织表达量也较癌旁组织高（P=0.0437）;CD86+含量比CD68+含量的比值（即CD86+/CD68+的比值）在胆管癌组织中低于癌旁组织（P=0.0146）;而CD163+含量比CD68+含量的比值（即CD163+/CD68+的比值）在胆管癌组织中高于癌旁组织（P=0.0109）。而GLS基因表达量与CD68+荧光标记数量呈正相关（r=0.5799,P=0.0481）、与CD68+＆CD163+荧光标记数量也呈正相关（r=0.7335,P=0.0066）。通过受试者操作特征曲线（ROC curve）可知曲线下面积（AUC）为0.819（95%CI 0.645-0.994）,有一定准确性,而GLS在CCA诊断灵敏度为91.7%,准确性为66.7%。通过亚组分析可知,HBs Ag阴性患者的GLS表达量明显高于阳性者（P=0.011）,而癌胚抗原（CEA）＜5ng/m L组GLS表达量明显高于CEA≥5ng/m L组（P=0.011）。结论:基于以上结果,我们推测,GLS可能通过代谢过程间接促进M2巨噬细胞极化,使M2巨噬细胞分泌WNT分子参与Wnt/β-catenin信号通路激活下游癌基因来促进胆管癌的增殖,GLS的表达差异有可能为CCA提供潜在的临床预后价值,并有可能在未来作为CCA治疗的新分子靶点。