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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）能够感染牛、猪、羊、鹿等牲畜,引起感染的动物尤其是牛会出现发热腹泻、生产力下降、产奶量减少等症状,具有较高的发病率和致死率,对全球养牛产业产生了巨大危害。外泌体是由哺乳动物细胞产生的一种能进行细胞间通讯的胞外小泡。在病毒感染过程中,病毒的核酸、蛋白质以及病毒粒子都能够由外泌体包裹实现在细胞之间的传播。研究表明BVDV可以促进细胞产生外泌体进而促进自身的复制。miRNA作为生物体内广泛存在的一种具有调控功能的单链RNA分子,也是外泌体的重要成分之一。目前尚无针对于BVDV感染细胞产生的外泌体及其内部miRNA的研究的报道,因此,对BVDV感染细胞产生的外泌体内的miRNA进行分析,并预测相应靶基因的功能,为阐明BVDV通过外泌体影响宿主细胞协助病毒感染的相关分子机制提供新的理论数据。本研究利用血清替代物代替牛血清培养牛肾细胞（MDBK）,将其无血清化。通过接种BVDV病毒液感染无血清化的MDBK,并收获感染细胞的上清液进行实时荧光定量PCR,并测定BVDV感染MDBK的效率。用MOI为1的BVDV病毒液感染无血清化的MDBK,收集72 h后的细胞上清液,利用超速离心的方法收集MDBK外泌体,并通过电镜观察感染BVDV和未感染BVDV的MDBK外泌体的形态变化,结果显示BVDV感染对MDBK外泌体的形态无显著影响。利用Western blot检测外泌体标志蛋白CD63和ALIX的表达情况,结果显示,感染BVDV和未感染BVDV的MDBK外泌体均表达了CD63和ALIX蛋白,不表达细胞质标志蛋白Calnexin,表明我们从细胞上清液中获取了感染与未感染BVDV的MDBK外泌体,为后续实验奠定了基础。利用Trizol法提取感染与未感染BVDV的MDBK外泌体总RNA,构建感染和未感染BVDV的MDBK外泌体的小RNA文库并进行测序分析。通过Q30软件评估测序结果的质量,结果显示每个RNA文库的Q30均在98%左右,表明转录组高通量测序结果良好,可用于下一步分析。通过与miRbase数据库、miRDeep2和RNAfold软件对测得的miRNA序列进行比对分析,结果共检测到678个miRNA,其中包括421个已知miRNA和257个新miRNA。随后统计比对到每条成熟miRNA上的tag数,作为该miRNA的原始表达量,并使用TPM方法对miRNA表达量进行标准化,结果显示,感染BVDV后共检测到71个高表达miRNA,其中包括4个新miRNA。通过比较感染/未感染BVDV的MDBK外泌体样品间的P-value和Fold Change,筛选差异表达的miRNA,结果显示,与未感染BVDV的MDBK外泌体miRNA相比,感染BVDV后共有110个miRNA表达量发生显著变化,其中包括个75上调miRNA和35个下调miRNA。利用R包的heatmap2函数对差异表达miRNA进行聚类分析,结果显示,感染BVDV和未感染BVDV的MDBK外泌体中呈现出聚类现象。为了进一步研究感染BVDV通过外泌体影响宿主细胞以及其协助病毒感染的相关分子机制,本研究利用Targetscan网站和miRanda网站预测了差异显著性前5的miRNA的潜在靶基因,并根据韦恩图取交集部分获得最终的靶基因,结果显示显著上调的miRNA共预测到47个靶基因,显著下调的miRNA共预测到30个靶基因。利用Targetscan分析miRNA和靶基因之间的靶点关系,并通过cytoscape软件绘制了miRNA-gene网络图,结果显示,IFNAR1基因被bta-miR-novel-chr2＿2377、bta-miR-novel-chr3＿3939和bta-miR-7共同调控,SIK1基因被bta-miR-novel-chr2＿2377和bta-miR-novel-chr3＿3939、bta-miR-16a和bta-miR-6524共同调控。然后通过在线分析软件GO category对靶基因进行功能富集分析,结果表明,差异显著性前5的miRNA的靶基因主要富集在I型干扰素信号通路、细胞因子活性、免疫受体活性和质膜组成成分等GO条目上,主要涉及到的靶基因为IFNAR1和IFNAR2。最后通过对感染BVDV后MDBK外泌体内差异表达miRNA的靶基因进行KEGG通路分析,结果显示,差异显著性前5的miRNA靶向的靶基因主要富集在抗叶酸抗性、丙型肝炎、JAKSTAT、Toll样受体等信号通路。以上结果表明感染BVDV影响了MDBK细胞外泌体中miRNA的表达模式,差异表达miRNA的靶基因主要富集在I型干扰素信号通路、细胞因子活性、JAK-STAT信号通路,该研究为阐明BVDV通过外泌体影响宿主细胞协助病毒感染的相关分子机制提供新的理论数据。