【摘 要】
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近年来,共培养技术已经成为挖掘新抗生素的重要手段,但是共培养微生物间的生态学关系及其促进产抗的机理还有待于深入探讨。本课题前期研究发现,在共培养过程中,Bacillus subtilis HNDF2能够刺激Brevibacillus laterosporus BL-21产生新的抗菌物质及提高发酵液的抗菌效果,但B.Subtilis HNDF2促进B.laterosporus BL-21产菌物质的机
【基金项目】
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国家自然科学基金（31370511）； 黑龙江省自然科学基金（C201203）；
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近年来,共培养技术已经成为挖掘新抗生素的重要手段,但是共培养微生物间的生态学关系及其促进产抗的机理还有待于深入探讨。本课题前期研究发现,在共培养过程中,Bacillus subtilis HNDF2能够刺激Brevibacillus laterosporus BL-21产生新的抗菌物质及提高发酵液的抗菌效果,但B.Subtilis HNDF2促进B.laterosporus BL-21产菌物质的机理以及二者之间的生态关系仍然不清楚。本论文旨在通过研究灭活与非灭活状态的HNDF2的群体密度、胞外代谢产物和细胞成分对BL-21产生抗菌物质的刺激作用,来揭示HNDF2刺激BL-21发酵液抗菌活性增强的机理。试验结果表明,灭活的HNDF2全液、营养体、芽孢、代谢产物对BL-21均没有刺激作用,这表明刺激BL-21产抗的物质不耐高温。非灭活的HNDF2培养液各部分的刺激结果表明:HNDF2全液对BL-21产抗的刺激作用最强,发酵液效价可达23.61±2.02AU/m L,比BL-21纯培养高45.57%;且二者同时接种,最有利于BL-21产抗;培养48h的HNDF2菌体的刺激效果最好。群体密度试验结果表明:当HNDF2的营养体密度达到1×10~7CFU/m L时,其刺激BL-21共培养产抗的效果最强,效价值可达30.42±2.73AU/m L;HNDF2营养体与BL-21同时接种最有利于BL-21产抗。当HNDF2的芽孢密度为1×10~5CFU/m L时对BL-21产抗的促进作用最强,效价值达到50.48±4.31AU/m L;且芽孢与BL-21同时接种对BL-21产抗刺激作用最强。HNDF2的肽聚糖成分没有刺激BL-21产抗的作用。非灭活的HNDF2代谢产物对BL-21产抗的刺激作用试验表明:HNDF2的碳代谢产物有显著的抑制或阻遏BL-21产抗的作用,其甘露糖代谢产物对BL-21产抗的抑制作用最明显;HNDF2氮代谢产物对于BL-21产抗有刺激作用,其中酵母粉的HNDF2代谢产物的刺激效果最显著,当酵母粉浓度为15g/L时对BL-21产抗的刺激效果最为突出,效价值达到41.53±6.88AU/m L;在此浓度下,加入量为3m L时刺激效果最强;以BL-21接入时间作为基准点,该产物与BL-21提前6h和同时接入培养基,最有利于刺激BL-21产抗。薄层色谱检测结果表明,HNDF2的酵母粉代谢产物的种类和产量均随发酵时间的不同有明显变化,其中Rf值为0.72的点为其特异点,且颜色随发酵时间延长而加深,表明其含量随着培养时间的延长而增加。电泳检测结果表明,培养24～60h的HNDF2酵母粉代谢产物与对照相比,在分子量为10k D处有一条特异条带。其酶解溶液的质谱分析结果显示,该蛋白分子量为11651.2 D,与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42的假定蛋白相匹配,匹配程度达90%。收集该蛋白溶液并检测其对BL-21产抗的刺激作用,结果显示其对BL-21产抗有明显的刺激作用。将经HNDF2酵母粉代谢产物诱导的BL-21发酵液与BL-21纯培养液进行对比分析,结果表明前者在55～170k D区间内的出现多条独有的特异条带,而从二者的抑菌活性上来看,前者也明显好于后者。两株芽孢杆菌分别与尖孢镰刀菌共培养的结果表明,BL-21与HNDF2均可以抑制尖孢镰刀菌的生长,但BL-21的抑制效果优于HNDF2,而当将两株芽孢杆菌与镰刀菌三菌共培养时,尖孢镰刀菌的生长量最少,抑制效果最好。群体感应基因及产抗基因检测结果表明,HNDF2的基因组中含有lux S基因,而BL-21没有lux S基因;BL-21的基因组中存在与细菌素、几丁质酶、蛋白酶、PKS和NRPS的生物合成相关基因。
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