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CRISPR/Cas9系统是精确靶向的基因编辑技术,该技术具有简单、高效的特点,能够实现同时对多个基因的编辑,这种强大的基因编辑能力已经被广泛应用于预防和治疗人类疾病方面的研究。但目前基于Cas9的核酸检测技术的研究相对较少。传统的以DNA杂交技术和DNA测序技术为代表的核酸检测技术成本高昂、周期长,基于Cas9/sgRNA系统的核酸检测方法有望克服这些不足。本研究结合CRISPR技术和PCR技术的优势,建立了一种基于CRISPR技术的新型核酸检测方法,即Cas9/sgRNA-typing PCR(ctPCR)法,实现了均相核酸检测。该方法的主要原理是利用一对Cas9/sgRNA复合物靶向结合目标DNA,通过Cas9切割DNA链,在结合位点上打开DNA双链,释放出一对游离的3′末端,同时用一对插入引物与游离DNA单链退火,提供模板;在DNA聚合酶的延伸下目标DNA片段的两端产生一对序列相同的通用PCR引物退火位点;最后可利用一种通用PCR引物进行PCR扩增,实现目标DNA的特异性检测。该方法的主要步骤包括:(1)反应组分的准备:反应组分包括预组装的Cas9/sgRNA复合物、热启动高保真DNA聚合酶、一对插入引物、通用PCR引物;(2)待测DNA检测:将上述组分按一定比例混合,组成PCR检测反应,通过设置PCR温控程序(37℃30min;72℃10 min;30个PCR扩增循环),在PCR仪上一次性完成切割、引物插入、延伸、扩增等步骤。整个检测过程中仅需在起始步骤一次性加入所需反应组分,后续检测过程中无需再打开检测管进行其他操作。本方法并不像传统PCR检测那样需要设计的特异性引物,由CRISPR系统控制检测的特异性。通过对10种不同人乳头状瘤病毒(HPV)亚型载体进行准确鉴定和分型,验证了该技术的可行性和特异性。随后利用该方法成功地在2种HPV阳性宫颈癌细胞,SiHa细胞gDNA(genomic DNA)和HeLa细胞gDNA中分别检测出两种高危型HPV(HPV16和HPV18)的L1基因片段,进一步证明了该方法在较复杂基因组背景下,具有较高的特异性和灵敏度。最后对30例临床样本经提取gDNA后进行检测分型,成功的检测出7例样品为HPV 58亚型,3例样品为HPV 52亚型,2例样品为HPV 45亚型,2例样品为HPV 18亚型,2例样品为HPV 59亚型,1例样品为HPV 16亚型,1种样品为HPV 35亚型,1种样品为HPV 56亚型。为了进一步验证检测结果,用针对L1区设计的兼并引物MY09/11对临床样本gDNA进行扩增并对扩增产物进行一代测序,测序结果所得的HPV亚型与ctPCR法的检测结果比较,验证了ctPCR方法的准确度。本研究建立的ctPCR方法可以对DNA进行检测和分型,为基于CRISPR技术的核酸检测提供了新的思路和方法。