马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是中国南方亚热带地区分布面积最广、重要的针叶造林树种之一,其耐干旱瘠薄、适应性强、速生丰产,在林业经济发展和生态环境中发挥着重要的作用。马尾松良种苗木缺乏,种子园种子产量低,且扦插无性繁殖具有年龄效应,这严重阻碍了马尾松良种的扩繁应用。林木体细胞胚胎发生具有高效、稳定、周期短等优势,可实现马尾松良种苗木的大规模快速繁殖。目前马尾松体细胞胚胎发生快繁体系已初步建立,但其胚性细胞团诱导率低,增殖培养中胚性保持困难,胚状体成熟分化困难瓶颈等制约着马尾松体胚发生快繁体系在生产实践中的应用。针对以上问题,本论文在2018年和2019年分别采集马尾松未成熟合子胚,开展马尾松胚性细胞团诱导及增殖体系优化研究,并探讨促进胚状体成熟分化发生的条件,为优化马尾松体细胞胚胎发生体系提供技术支撑。结果如下:1.马尾松胚性细胞团的诱导针对马尾松胚性细胞团诱导率低的问题,本研究通过外植体材料的选择(基因型,合子胚发育阶段)以及培养基成分(碳源、氮源)的调整成功提高了胚性细胞团诱导率。研究结果表明,外植体选择未成熟合子胚的2-4阶段是最适宜胚性细胞团诱导的“窗口期”;同期采种的不同家系其诱导率有显著地差异,既可能有基因型的影响,也有可能有合子胚发育不同步的影响;2018年筛选出2个诱导敏感的基因型,其平均诱导率均高于15%,2019年筛选出3个诱导敏感的家系,其最高诱导率均在20%以上;通过调整诱导培养基中碳源C、氮源N浓度及水平,对提高马尾松胚性细胞团诱导率有促进作用,如在所研究的4个家系(K1,K2,K3,K4)中,K1家系在蔗糖(30g/L)处理中获得了最高诱导率,达到40%,而K3家系在葡萄糖(30g/L)处理中获得其最高诱导率(22%),表现出家系基因型和碳源类型与浓度的交互作用影响;适当提高培养基的硝态氮(NO3-)浓度对马尾松胚性细胞团的诱导有一定地促进作用,3/2LP的硝态氮浓度处理获得了较高的诱导率(15.48%),高于原LP处理下的诱导率(9.19%),适当降低铵态氮(NH4+)的浓度水平,对胚性细胞团的诱导有利,且氨硝比(NH4+/NO3-)的范围在0.2～0.4时其平均诱导率为14.23%,均高于其它处理组。2.胚性细胞团的胚性保持与稳定增殖为探讨胚性细胞团增殖稳定性问题,开展了调节胚性细胞团增殖培养的环境温度的研究,发现,适当降低胚性细胞团培养的环境温度,能一定程度地减缓胚性细胞团增殖过程中的老化进程,并可在较长的一个增殖培养时期内继续保持稳定增殖的胚性状态,这为在增殖过程中维持和保持胚性细胞团的胚性状态提供了一个简单有效的途径。研究发现,培养环境温度分别设置低(5℃,10℃,15℃)、中(23℃)、高(28℃)的实验处理时,发现15℃的环境温度对胚性稳定保持有利,而28℃的培养环境将加速胚性细胞团的老化过程,对其胚性保持不利。培养基的液态、固态等不同增殖培养方式对胚性细胞团的增殖有显著的影响。与固态培养方式(对照)比较,悬浮和液态-固态的增殖培养方式均获得较高的增殖系数,其中悬浮培养方式下的增殖系数约为固体培养下的2倍,在液-固培养方式下,随着悬浮天数的延长(3d,4d,5d,6d),转入固体培养基后的胚性细胞团增殖系数逐渐升高,悬浮6d后转入固体培养基培养,其增殖系数高达13.53,显著高于固体培养方式(5.43),且悬浮处理时,增殖细胞团的极性结构发育,有利于胚性保持。3.体细胞胚的分化与成熟对处于不同发育阶段及不同状态的马尾松增殖胚性细胞团成熟分化实验的研究表明,成熟分化过程中,对胚性细胞团外表形态表现为白色、不透明、粘性、凝脂状,且表面有明显突起,显微镜下可观察到有大量发育到早期体细胞胚的胚性细胞团,在ABA激素的成熟分化培养基上,可分化出成型的体细胞胚。胚性细胞团一旦已达到成熟分化的状态,继续增殖培养将使已获得胚性发育的细胞团迅速衰老、褐化,失去分化潜能。本实验研究结果表明,增殖继代3代之后,要随时密切关注胚性细胞团的发展状态,及时转入成熟培养基中进行成熟培养,促使胚状体成熟分化顺利完成。4.马尾松胚性细胞团诱导与增殖阶段细胞学观察实验中对诱导过程中出现的胚性与非胚性细胞团进行了鉴别,发现正常的胚性细胞团表现为白色,蓬松,表明有明显突起,内部存在明显ESM结构;同时在增殖过程中发现随着继代次数的增加,胚性细胞团的胚性质量呈先增加后降低的趋势,在继代培养3代时胚性细胞团胚性质量最佳,表现为具有较多数量的极性结构发育明显的早期体细胞胚,而继代培养4代后胚性细胞团逐渐老化,转化为淡黄色颗粒状细胞团,失去极性结构,这种老化的胚性细胞团对成熟分化培养不利。