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肿瘤作为一种严重影响机体健康的疾病,其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。由于肿瘤发病原因的复杂性和异质性,单一的治疗手段无法达到预期的疗效。为解决上述问题,联合治疗提供了良好的策略,其中联用药物的协同效果是增强肿瘤治疗的关键。CDK4/6-cyclin D通路是影响肿瘤细胞增殖重要途径,玻玛西尼(Abemaciclib)是一类小分子激酶抑制剂,可选择性抑制细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4/6,抑制视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma Protein,RB)磷酸化,将肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G1期,对细胞增殖起到抑制作用。周期蛋白D(cyclin D)的表达受到多种信号因子(如内皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)、核因子 κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)等)调控。IMD-0354 是一种 NF-κB 抑制剂,通过影响NF-κB信号通路,降低cyclin D的表达,从而减少cyclin D与CDK4/6结合物结合能力,对周期治疗模式具有促进作用。因此,Abemaciclib与IMD-0354联用可同时抑制CDK4/6和cyclin D,增强对CDK4/6-cyclin D通路的抑制,实现化学协同治疗,增强抗肿瘤能力。Abemaciclib可选择性抑制调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)的增殖,在一定程度上改善肿瘤免疫抑制微环境。IMD-0354可通过抑制NF-κB通路,将肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophage,TAM)从免疫抑制的M2型极化为具有免疫激活作用的M1型,减弱肿瘤部位的免疫抑制作用,激活肿瘤免疫。因此,两药联用能够抑制Tregs的增殖和将M2 TAMs重极化为M1 TAMs,平衡肿瘤免疫微环境,发挥免疫治疗协同作用。因此,将Abemaciclib和IMD-0354 联用,同时产生化疗协同治疗、免疫协同治疗,并进一步实现化学免疫联合治疗,具有三重协同,可望有效增强抑瘤效果。由于Abemaciclib与IMD-0354的理化性质存在差异,导致药物在体内的药动学行为不同,从而影响了联合治疗效果。共递送纳米递送系统因其具有将两种药物共递送至肿瘤部位、增强药物在肿瘤部位蓄积、控制药物释放速率等优势引起人们广泛关注。传统纳米递送系统在递送过程中,为了避免血管网状内皮系统的清除作用,一般设计为负电性且粒径在100-200 nm范围内。而当纳米递送系统进入肿瘤组织后,一方面由于细胞膜呈现负电性,在一定程度上阻碍了肿瘤细胞对负电性纳米递送系统的摄取能力;另一方面,由于肿瘤组织致密的细胞外基质和较高的组织间压力使得其在肿瘤部位的渗透能力较弱,降低药效。基于上述理论,设计新型纳米递送系统,具有电荷和粒径可在肿瘤部位触发式转变、增强肿瘤细胞摄取和肿瘤组织深层渗透等优势,是解决上述问题的关键。基于上述理念,本课题提出电荷和粒径双转变纳米笼策略,同时递送Abemaiclib和IMD-0354,以期提高肿瘤化学免疫联合治疗效果。首先合成靶向分子天门冬酰胺酸-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arginine,NGR)修饰的pH响应型电荷翻转材料NGR-PEG-PLL-DMA(ND),并与分别装载Abemaciclib和IMD-0354的PAMAM小球(PA和PI)通过静电作用自组装为共载纳米笼(PA/PI-ND)。Abemaciclib和IMD-0354作用于CDK4/6-cyclin D通路将肿瘤细胞周期共阻滞于G1期,实现化疗协同作用;同时,二者联用可减弱肿瘤的免疫抑制作用,激活肿瘤免疫,发挥免疫协同作用;在化疗协同和免疫协同的基础上,发挥化学免疫协同治疗效果。PA/PI-ND在NGR靶向分子的介导作用下主动靶向至肿瘤部位,从而共递送药物至肿瘤部位;在肿瘤微酸性环境中,PA/PI-ND由负电转变为正电,响应性解聚出载药小球PA和PI,实现电荷和粒径双转变,有利于增强药物在肿瘤部位的蓄积量和深层渗透能力,提高治疗效果。本课题主要研究内容和结果如下:1.Abemaciclib及IMD-0354含量测定方法学的建立Abemaciclib和IMD-0354的含量测定方法分别通过高效液相色谱法建立。结果表明,该方法学专属性强,在设定浓度范围内线性关系良好,精密度和回收率均符合要求,能够用于Abemaciclib和IMD-0354含量测定。2.共载Abemaciclib和IMD-0354双转变纳米笼的制备及表征本课题首先合成了电荷翻转材料,通过考察材料的电荷翻转性能,筛选出电荷翻转材料 Maleimide-Poly(ethylene glycol)-Poly(L-lysine)-Dimethylmaleic Anhydride(MAL-PEG-PLL-DMA),其可在pH 6.5(模仿肿瘤组织微酸性环境)下电位由负电翻转为正电。合成了靶向分子NGR修饰的pH敏感电荷翻转材料NGR-PEG-PLL-DMA(ND)。通过薄膜分散法分别制备装载Abemaciclib和IMD-0354的PAMAM小球(PA和PI),采用静电吸附法制备共载纳米笼PA/PI-ND。然后通过粒径电位测定仪、透射电镜对粒径、电位、形态和电荷翻转性能等进行评价。结果表明,PA/PI-ND形态圆整,粒径为177.7±5.8nm,电位为-11.17±0.45 mV。PA/PI-ND表面电位在微酸性环境(pH6.5)下由-11mV翻转为7mV左右,粒径从180nm转变为5 nm左右,可实现电位和粒径双响应转变。体外释放实验结果表明,Abemaciclib和IMD-0354在pH 6.5条件下的累积释放百分率分别为50.8%和45.2%左右,与pH 7.4条件下累计释放率(35.3%和32.7%)相比显著提高(p<0.01,p<0.05),表明PA/PI-ND具有良好的pH敏感释放性能。3.共载Abemaciclib和IMD-0354双转变纳米笼的递送行为评价采用结直肠癌为动物模型,在细胞水平和动物水平考察了 PA/PI-ND的主动靶向行为、共递送效率和深层渗透能力。细胞摄取实验和小鼠成像实验结果证明PA/PI-ND通过NGR靶向分子的介导主动靶向肿瘤部位,提高药物在肿瘤部位的蓄积能力。体内体外共定位实验结果表明,PA/PI-ND能将两种药物有效地共递送至肿瘤部位。体外细胞摄取实验结果表明,肿瘤细胞和M2型巨噬细胞能够摄取药物,且在pH 6.5条件下的摄取量与pH 7.4条件下相比显著增加(p<0.001)。体内体外深层渗透实验结果表明PA/PI-ND在肿瘤部位具有深层渗透能力。以上结果表明,PA/PI-ND的触发式解聚有利于增强细胞摄取和组织深层渗透。4.共载Abemaciclib和IMD-0354双转变纳米笼的药效学与安全性评价以CT-26和MCF-7为细胞模型,通过细胞毒性实验、细胞周期阻滞实验等考察PA/PI-ND的化疗协同作用。Abemaciclib和IMD-0354联用比例为5:1时,在CT-26和MCF-7上的协同指数分别为0.412和0.539,具有协同作用。同时PA/PI-ND具有较高的细胞毒性,能够有效地将CT-26和MCF-7细胞周期阻滞于G1 期(62.46%和 73.26%),同时 PA/PI-ND 可以降低 p-RB 和 cyclin D 的水平,具有化疗协同作用。免疫学评价实验中,PA/PI-ND能有效促进M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞,降低Treg 比例、提高CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量、提高免疫激活性细胞因子INF-γ、IL-12和TNF-α的水平同时降低相关免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β的水平,削弱肿瘤部位的免疫抑制作用,同时激活抗肿瘤免疫能力。体内抑瘤实验结果表明,PA/PI-ND组的小鼠瘤重显著低于PA-ND组和PI-ND组(p<0.01、p<0.001)。上述结果表明PA/PI-ND能够产生良好的化学免疫联合治疗效果。通过肿瘤组织H&E染色、Ki67染色和TUNEL染色实验进一步考察抑瘤效果,结果表明PA/PI-ND能够促进肿瘤细胞坏死和凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,增强疗效。此外,体内主要脏器H&E染色实验和血液学分析数据结果表明PA/PI-ND组主要脏器未见明显病变,测定的血液学指标相比于生理盐水组无明显变化。综上,基于化学免疫联合治疗,本课题提出电荷和粒径双转变纳米笼策略,构建了共载Abemaciclib和IMD-0354的pH响应型电荷和粒径双转变纳米笼。该纳米笼具有主动靶向、电荷翻转、粒径转变、共递送和组织深层渗透等多种功能,在化疗协同和免疫协同的基础上,实现化学免疫联合治疗,为药物载体的进一步设计和肿瘤联合治疗模式提供了新的有效策略。