论文部分内容阅读
前言: 术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)作为临床手术病人术后重要的并发症,将会严重影响老年患者的生活质量。术后认知功能障碍多发生于老年患者,但是确切的机制是未知的而且围术期众多因素混杂其中。 许多研究已经将焦点集中于外科手术这个初始条件。我们的实验室和许多研究已经证明老年鼠手术后脑海马区炎性反应的刺激导致大量因子释放,例如IL-1β、IL-6、TNF-α等过度表达。AD病人海马区炎性因子也被大量观察到,而Aβ的过度表达、凝聚,更是AD患者发病机理的核心。 实际上有研究已经发现AD病人与对照组比较细胞炎性因子水平增加。另外,AD病人大脑中星形胶质细胞激活也导致Aβ沉积。这样就推测POCD和AD可能存在相似的病理生理机制。早期研究已经证明炎性因子在外科病人术后认知下降中扮演重要角色。然而,AD病人相关路径的分子机制和海马区炎性因子的关系是不好理解的。以前研究已经证明TGF-β(一种在AD病人脑内过表达的细胞因子)无论体内实验还是体外实验均诱导APP堆积,促进Aβ形成,通过Smad3信号通路激活星形胶质细胞。但是缺乏直接的证据来证明而仅仅是推断POCD时TGF-β/Smad信号通路可能发生重要作用。 本研究拟通过描述一种新的由Th17细胞产生的细胞炎性因子IL-17A,发现其在粘膜免疫、组织炎性反应、自身免疫反应等方面扮演的关键角色。我们阻断了老年小鼠肝部分切除术后IL-17A/IL-17R来评估POCD中IL-17的作用。我们假设外科手术刺激诱导IL-17释放伴随显著的海马区炎症反应和记忆损伤。本研究的目标有两个:一,确定IL-17触发老年肝部分切除术小鼠海马区炎症反应。二,TGF-β/Smad信号通路对这些神经病理学和生化改变有贡献。 材料与方法: 14-20月龄雄性C57BL/6小鼠,体重30-40g。饲养在室温23°、湿度恒定、灯光12小时昼夜轮换房间,自由进食及饮水。 实验一:小鼠随机分为对照组(C组),假手术组(A组)、手术组(SA组)、单克隆抗体组(SI组)、IgG组(SC组)。单克隆抗体组(SI组)和IgG组(SC组)于常规水迷宫训练前3天进行侧脑室置管。所有五组均在术前5天进行常规水迷宫训练。对照组(C组)不作任何处理。假手术组(A组)实验动物术前12小时禁食,自由饮水,0.6%戊巴比妥钠(50mg/kg体重)腹腔注射麻醉,不进行手术操作。手术组(SA组)实验动物戊巴比妥钠麻醉后行肝部分切除术。单克隆抗体组(SI组)(肝切除术同时)侧脑室注射IL-17单克隆抗体4μg。IgG组(SC组)注射兔抗鼠IgG2a(肝切除术同时)。 所有五组均在术后7天进行常规水迷宫训练,术后1、3、7天进行空间探索试验,时间限定90s。C组A组SA组于术后24h、72h、7d水迷宫测试后各处死小鼠,单克隆抗体组(SI组)及IgG组(SC组)术后72h水迷宫测试后处死2/3小鼠,取海马组织,-70℃保存,等待RNA(mRNA)检测及Western blot检测。 实验二:C57BL/6小鼠星形胶质细胞的分离培养,培养2周后将少突胶质细胞和小神经胶质细胞从星形胶质细胞中机械分离出去。免疫荧光检测GFAP(胶原原纤维酸性蛋白)的表达鉴定星形胶质细胞。分为四组: 1)对照组,没有干预; 2)IL-17组,给于IL-17; 3)阳性对照组,给于IgG2a; 4)干预组,先加入IL-17RA-siRNA转染细胞24h,再加入IL-17。分别于培养1h、24h和48h收集细胞,Real-time PCR及Western blot检测IL-17A、IL-6、TGFβ、Smad2/3、APP和Aβ的表达。 分为两组,分别加入IL-17A及IL-17A+TGFβⅠ型受体选择性抑制剂TβRI(5uM),于培养24h收集细胞。Real-timePCR及Western blot检测TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3、APP、Aβ的表达。 统计方法: 数据统计结果以均数±标准差((x)±s)表示,采用SPSS16.0统计软件进行统计分析。同组间参数分析利用t检验,不同组间参数比较利用单因素或多因素方差分析,后继Dunnett t检验,以P<0.05为有统计学意义。 研究结果: 实验一:各组实验小鼠术前训练后认知功能上升,对照组及单纯麻醉组实验小鼠术日后认知功能无改变。手术创伤组的老年小鼠术后发生认知功能损害,以第三天为高峰,七天恢复。手术创伤组海马区IL-17A表达在术后第一天显著增加,术后第三天的星形胶质细胞标记物GFAP表达增多.同时,术后三天时TGF-β、Smad、APP和Aβ等表达显著增加,维持高水平至术后第七天。IL-17单克隆抗体组的IL-17蛋白表达显著减少,APP、pSmad蛋白表达相应减少。 实验二:IL-17A组TGF-β、Smad1h即表达,24h达到高峰,48h小时轻微衰减。IL-17RAsiRNA组各个时点TGF-β、Smad表达均受抑制。IL-17A组显著上调APP、Aβ等的mRNA及蛋白表达,而IL-17RA siRNA组则相反。加入TGF-βRI组(TGF-β抑制剂)和IL-17A组比较抑制了TGF-β、pSmad、Aβ等的表达水平。 结论: 1、老年C57BL/6小鼠肝部分切除术为模型触发的一系列的神经认知功能下降是和IL-17诱导的神经胶质细胞活化、持续Aβ产生、海马TGF-β/Smad途径相关的。 2、阻断IL-17炎症因子或者阻断TGF-β/Smad信号通路均可以减少手术创伤诱发的炎症反应造成的认知损害。