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目的:构建小鼠p38MAPK基因shRNA慢病毒载体。方法:根据siRNA设计原则,设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与酶切线性化后的PLL3.7载体连接转化,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定。重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒液,流式细胞仪检测病毒滴度。p38MAPK-shRNA慢病毒感染体外培养的MC3T3-E1成骨细胞,72小时后荧光显微镜下观察MC3T3-E1成骨细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达以分析感染效率,荧光定量PCR检测MC3T3-E1成骨细胞p38MAPKmRNA表达,进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选。结果:酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×10~8、2.8×10~8、2.5×10~8 TU/ml。p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1成骨细胞后,荧光显微镜下观察各慢病毒载体感染效率达到74%以上,荧光定量PCR结果显示,3个干扰片段都有不同程度的干扰效果,与正常对照组、阴性病毒对照组相比, p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3转染组MC3T3-E1成骨细胞p38 MAPKmRNA表达水平分别下降了78.8%、84.3%和60.2% ( P<0.01 ) ,其中以p38MAPK-shRNA2的干扰效率最高。结论:成功构建了3组靶向p38MAPK基因RNA干扰慢病毒载体,成功转染MC3T3-E1成骨细胞,有效抑制MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK基因表达,其中以p38MAPK-shRNA2的抑制效率最高。目的:观察高糖对MC3T3-E1成骨细胞凋亡及凋亡相关基因Capase3、bax、bcl-2及活化蛋白-1(AP-1)表达的影响,探讨p38MAPK在高糖诱导成骨细胞凋亡中的作用方法:构建成功的p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养的MC3T3-E1成骨细胞,并分为:正常对照组、高糖组、p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染组、p38MAPK信号转导抑制剂组、无关shRNA转染组。培养7天后收集细胞,RT-PCR检测MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK mRNA表达,TUNEL、流式细胞术检测MC3T3-E1成骨细胞凋亡率,透射电镜观察MC3T3-E1成骨细胞形态改变,Western blot检测MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK、p-p38 MAPK、Caspase-3、bax、bcl-2蛋白水平,EMSA法检测MC3T3-E1成骨细胞AP-1活性。结果:p38MAPK-shRNA慢病毒载体成功转染MC3T3-E1成骨细胞。与正常MC3T3-E1成骨细胞相比,高糖组和无关shRNA转染组MC3T3-E1成骨细胞形态发生改变:透射电镜下细胞表面微绒毛减少、细胞膜欠完整、内质网扩张、染色质边聚浓缩;而p38MAPK-shRNA转染组较高糖组明显减轻。和正常对照组相比,高糖组、无关转染组MC3T3-E1成骨细胞凋亡率显著增加(p<0.01);p38MAPK-shRNA转染组及p38MAPK信号抑制剂组较高糖组,MC3T3-E1成骨细胞凋亡率明显减少,分别减少了50.8%、37.5%(p<0.01,p<0.05)。RT-PCR结果显示,高糖组和无关shRNA转染组MC3T3-E1成骨细胞p38MAPKmRNA表达较正常对照组明显增加( p<0.01 );p38MAPK-shRNA转染显著降低高糖所诱导的MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK过度活化,p38MAPKmRNA表达下调,与高糖组和无关转染组相比有统计学差异(p<0.01)。Western Blot检测显示,高糖诱导MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达明显增加(p<0.01);而p38MAPK-shRNA转染及p38 MAPK信号抑制剂干预后,MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组和无关shRNA转染组明显降低,差异有统计学意义(p<0.01,p<0.05)。和正常对照组相比,高糖组、无关shRNA转染组MC3T3-E1成骨细胞Caspase-3以及促凋亡基因bax蛋白表达明显上调,而凋亡抑制基因bcl-2蛋白表达明显下调(p<0.01);予p38MAPK-shRNA转染及p38MAPK信号转导抑制剂后,MC3T3-E1成骨细胞Caspase-3以及bax蛋白表达水平较高糖组和无关转染组明显降低,bcl-2蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(p<0.01,p<0.05)。EMSA法检测结果显示,高糖刺激MC3T3-E1成骨细胞AP-1活性明显增加(P<0.01),p38MAPK-shRNA转染及p38MAPK信号转导抑制剂可明显抑制MC3T3-E1成骨细胞AP-1的活性,其较高糖组分别降低57.9%和45.6%,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论:高糖通过激活MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK,活化AP-1,上调bax、Caspase-3基因表达,下调bcl-2表达,激活线粒体凋亡途径,从而诱导MC3T3-E1成骨细胞凋亡。p38MAPK-shRNA慢病毒载体能有效抑制MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK基因表达,从而减轻高糖所诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡。本研究为糖尿病性骨质疏松防治提供一新的理论基础。