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背景牙周病是人类口腔中两大最常见的疾病之一,在世界范围内均有较高的患病率。牙周病治疗的最终目的是实现牙周组织的再生,形成牙周新附着。多年来,人们一直在寻求有效增加牙周新附着、促进牙周组织再生的治疗方法,开展了包括牙周骨移植、生长因子应用及引导牙周组织再生治疗术在内等多方面的研究,并取得了一定的进展,但均不能实现牙周组织的完全再生。近年来,用于组织工程的水凝胶生物材料的研制发展迅速。许多研究表明,壳聚糖水凝胶是一类生物相容性好、可体内降解的生物材料,作为牙周组织工程细胞支架具有广泛的应用前景。羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl Chitosan,CMCS)是壳聚糖(Chitosan)经羧甲基化而得的一种水溶性多糖。与壳聚糖相比,羧甲基壳聚糖的水溶性提高,且无毒,无抗原性,具有可降解性,生物相容性好等优点,在医药和保健食品方面的用途日益广泛。有关壳聚糖温敏水凝胶材料的研究近年来报道很多,但针对羧甲基壳聚糖温敏凝胶的研究较少。目的自制羧甲基壳聚糖温敏凝胶同时选择多种影响因素优化配方组成,研究其理化性能和对小鼠肺成纤维细胞L929的毒性作用,并且通过动物实验探讨其组织相容性,为进一步的临床应用提供基础实验依据。方法本研究分为两部分1羧甲基壳聚糖温敏凝胶的制备称取的一定量的羧甲基壳聚糖(CMCS)加入一定浓度的盐酸溶液45ml中,(23±1)℃溶解2 h后,称取一定量的甘油磷酸钠(GP)溶解于1mL超纯水中,在连续搅拌下,缓慢滴加入羧甲基壳聚糖滤液中,得到清澈透明的配合物溶液,再继续搅拌20min混合均匀,备用。将装有CMCS/GP配合物溶液的试管置于30℃～70℃水浴中,达到初始凝胶化温度(IGT)后,恒温一定时间,得到水凝胶。通过调节盐酸的浓度、羧甲基壳聚糖的取代度、甘油磷酸钠的浓度以及羧甲基壳聚糖的浓度来研究其对羧甲基壳聚糖温敏凝胶初始凝胶化温度的影响,从而优化配方组成,制备出能在体温环境下发生凝胶化的医用材料。2评价羧甲基壳聚糖温敏凝胶的生物相容性2.1羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠肺成纤维细胞L929的细胞毒性作用采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定不同浓度的羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液对体外培养的L929细胞的细胞毒性。测定加样后24h、48h、72h、96h的吸光度值(OD),计算细胞相对增殖率(RGR),评定细胞毒性等级。2.2小鼠皮下埋植实验常规消毒、铺单,在小鼠腿部外侧皮肤切开长1cm的创口,将0.5ml的羧甲基壳聚糖温敏凝胶植入小鼠皮下,空白对照组小鼠在埋植的相同部位除不植入凝胶外,其余步骤相同。缝合筋膜、皮肤。观察各组小鼠在注射凝胶后植入材料周围肌肉组织的外观,然后分别在3、7、14天处死。切除植入部位及周围组织放入福尔马林液固定,常规组织切片,HE染色观察凝胶周围组织的炎症反应,评价各组凝胶的组织相容性。结果1制备出柔软、湿润并具有能随环境温度的变化发生可逆性的水凝胶。通过正交化实验优化配方组成后,当羧甲基壳聚糖取代度为0.3,羧甲基壳聚糖浓度为5.0%,盐酸浓度为0.1 mol/m3,GP浓度6.3%时,IGT为37℃最为接近人的口腔温度。2羧甲基壳聚糖温敏凝胶的生物相容性2.1羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠肺成纤维细胞的细胞毒性作用。2.1.1加样24h后,0.4倍和0.08倍浸提液组与其他各组的OD值比较差异有统计学意义,P<0.05;其余各组OD值比较差异无统计学意义,P>0.05。2.1.2加样48h后,50倍浸提液组与阴性对照组及阳性对照组OD值比较差异无统计学意义,P>0.05;其余各实验组的OD值与阴性对照组比较差异有统计学意义,P<0.05。2.1.3加样72h后,50倍浸提液组与阴性对照组OD值比较差异无统计学意义,P>0.05;50倍浸提液组及阴性对照组与阳性性对照组OD值比较差异有统计学意义,P<0.05;其余各实验组OD值与阴性对照组比较差异有统计学意义,P<0.05。2.1.4加样96h后,50倍浸提液组与阴性对照组OD值比较差异有统计学意义,P<0.05;50倍浸提液组及阴性对照组与阳性性对照组OD值比较差异有统计学意义,P<0.05;其余各实验组OD值与阴性对照组比较差异有统计学意义, P<0.05。2.2小鼠皮下埋植实验本实验组织学表明,凝胶注射后前3d,实验组以急性炎症为主,中性粒细胞大量聚集,淋巴细胞较多,并见巨噬细胞,毛细血管充血;凝胶注射7d后,实验组有少量波浪形胶原纤维形成,毛细血管减少,血管充血程度降低,炎症细胞的数量明显减少,未发现新生的毛细血管;到14d实验组炎症细胞基本消失。说明羧甲基温敏凝胶具有很好的组织相容性。结论1研究羧甲基壳聚糖温敏凝胶的制备方法,制备出在室温下为液体,在体温环境下发生凝胶化的具有温敏特性的医用材料。2对羧甲基壳聚糖温敏凝胶的生物相容性进行了初步评价,证明其对L929成纤维细胞没有显示出毒性,并且有促进细胞增殖的作用,其中0.4倍浸提液促细胞增殖作用最为明显。小鼠皮下埋植实验结果表明14d后即看不到炎症细胞并与正常对照组无明显差别,说明羧甲基壳聚糖温敏凝胶具有良好的组织相容性。