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本研究以牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cell line,MAC-T)作为研究对象,在建立乳房链球菌0140J(Strepttococcus uberi s0140J,S.uberis 0140J)与MAC-T共孵育模型的基础上,探讨了牛磺酸(taurine)对S.uberis 0140J感染MAC-T引起的肌醇磷脂/Ca2+系统介导的信号通路以及细胞炎性反应的影响。结果如下:1牛磺酸对肌醇磷脂/Ca2+系统介导的信号通路及细胞炎性反应的影响本章试验以β-丙氨酸(β-alanine)作为牛磺酸的摄取抑制剂,将MAC-T经不同处理后分为 8 组,分别为 control 组、S.uberis组、taurine 组、S.uberis+taurine 组、β-alanine组、β-alanine+taurine 组、β-alanine+S uberis组、β-alanine+taurine+S uberis组,探讨了牛磺酸在S.uberi s0140J感染MAC-T时对肌醇磷脂/Ca2+系统介导的信号通路及细胞炎性反应的影响。试验首先采用流式细胞术检测S.uberis 0140J与MAC-T共孵育后胞内Ca2+的变化;其次利用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白免疫印迹(Western blot,WB)及荧光的方法分别检测肌醇磷脂含量(分别为磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-biphosphate,PIP2)、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-1,4,5-trisphosphate,PIP3)、三磷酸肌醇(inositol-1,4,5-trisphosphate,IP3))、Ca2+信号相关蛋白的表达及核转录因子的活性变化;然后流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平、化学试剂盒检测一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的活性、一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)和乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)的活性;最后利用蛋白芯片技术检测相关炎症因子分泌的变化,荧光定量和ELISA检测肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素6(interleukin6,IL-6)的转录和翻译水平;系统的讨论牛磺酸对S.uberis 0140J感染的MAC-T中内肌醇磷脂/Ca2+系统介导的信号通路以及炎性细胞反应的影响。研究结果表明:S.uberis 0140J感染2h后,PIP3、IP3的含量显著上升(P<0.05),PIP2的含量显著降低(P<0.05),细胞核内核转录因子(包括核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和活化 T 细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT))含量显著增加(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6 的 mRNA 水平显著上升(P<0.05);牛磺酸预处理可明显降低PIP3、IP3的含量(P<0.05),升高PIP2的含量(P<0.05),降低核内核转录因子的含量(P<0.05),减少TNF-α、IL-1 β、IL-6的mRNA水平(P<0.05)。在感染3h后,细胞内Ca2+浓度显著上升(P<0.05);而预处理牛磺酸则能显著降低细胞内的Ca2+(P<0.05)。在感染4h后,磷脂酶C-γ1(phospholipase C-yl,PLCγ1)、磷脂酰肌醇-3 羟基酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)、张力蛋白同源物磷酸酯酶(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)、蛋白激酶 C-α(protein kinase C-α,PKCα)、NF-κB 抑制蛋白激酶-α(inhibitor of NF-κB kinase,IKKα)、NF-κB 抑制蛋白-α(NF-κB inhibitor-α,IκBα)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的蛋白表达水平和磷酸化水平、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)的活性和钙调蛋白(calmodulin,CaM)的蛋白含量均显著上升(P<0.05),细胞内的ROS含量、iNOS的活性、培养上清中NO的含量、NAGase和LDH的活性及细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的蛋白水平均显著升高(P<0.05);牛磺酸预处理可显著降低PLCγ1、PI3K、PTEN、PKCα、IKKα、IκBα、GSK-3β的蛋白表达水平和磷酸化水平、CaN的活性、CaM的水平、细胞内的ROS含量、iNOS活性,培养上清中NO的含量、NAGase和LDH的活性及细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的蛋白水平(P<0.05):蛋白芯片结果表明S.uberis0140J感染组上清中大部分细胞因子(24/40)的表达高于空白对照组(倍数变化>1);预处理牛磺酸(33/40)后,大部分细胞因子表达低于感染组(倍数变化<1)。以上结果表明牛磺酸可降低MAC-T由S.uberis 0140J感染引起的肌醇磷脂组分之间的转变(PIP2转化为PIP3和IP3),细胞内Ca2+浓度的升高,Ca2+相关信号蛋白的表达、核转录因子的活性、细胞的氧化和损伤及下游相关炎症因子的分泌,说明了牛磺酸缓解MAC-T在S.uberis 0140J引发的炎症中的机制与肌醇磷脂/Ca2+信号密切相关。2干扰Ca2+动员或NF-κB、NFAT转录活性相关蛋白后牛磺酸的抗炎作用为进一步证实牛磺酸在S.uberis 0140J感染MAC-T中与肌醇磷脂/Ca2+系统介导的信号通路的相关性,本章试验通过干扰RNA(small interference RNA,siRNA)干扰关键蛋白表达(siPLC、siCaN、siPKC)抑制Ca2+动员或NF-κB、NFAT转录活性,将细胞经不同处理后分为18组,分别为control组、S.uberis组、taurine组、S.uberis+taurine 组、转染试剂(MOCK)组、阴性对照(NC)组、siPLC 组、siPLC+taurine组、siPLC+S uberis组、siPLC+S.uberis+taurine 组;siCaN 组、siCaN+taurine 组、siCaN+S.uberis组、siCaN+S.uberis+taurine 组;siPKC组、siPKC+taurine 组、siPKC+S.uberis组、siPKC+S.uberis+taurine组。首先利用荧光定量确定有效的siRNA及流式细胞术检测S.uberis 0140J与MAC-T共孵育后MAC-T中Ca2+和ROS的含量变化;然后ELISA检测细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)在细胞培养上清中的水平;最后化学试剂盒检测细胞损伤指标(NAGase、LDH活性)。研究结果显示:感染3 h后,siPLC、siCaN的感染组与S.uberis 0140J感染组相比MAC-T内的Ca2+浓度显著降低(P<0.05):与siPLC、siCaN、siPKC的感染组相比,添加牛磺酸后,MAC-T内的Ca2+浓度显著降低(P<0.05)。4h 后,siPLC、siCaN、siPKC 感染组内的 MAC-T 的 ROS含量、上清中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平、NAGase活性与LDH活性显著降低(P<0.05);添加牛磺酸后,MAC-T内的ROS含量、上清中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平、NAGase活性与LDH活性进一步明显的降低(P<0.05)。研究结果表明:通过干扰关键蛋白表达来抑制Ca2+动员或抑制NF-κB、NFAT转录活性可以降低因S.uberis 0140J引起的MAC-T内Ca2+浓度、ROS含量、炎症因子的分泌及细胞培养上清中的NAGase、LDH的活性的上升;牛磺酸的添加能够进一步的降低Ca2+浓度、ROS含量、炎症因子的分泌及细胞培养上清中的NAGase、LDH的活性:这些结果为牛磺酸通过肌醇磷脂/Ca2+信号介导的炎症通路缓解S.uberis 0140J感染的机制提供补充。3抑制Ca2+动员或抑制NF-κB、NFAT转录活性后牛磺酸的抗炎作用本章试验通过PLC抑制剂 U 73122(溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF))、CaN 抑制剂 FK 506(溶剂为水)、PKC 抑制剂RO 31-8220(溶剂为二甲基亚砜砜(dimethyl sulfoxide,DMSO))来抑制 Ca2+动员或抑制NF-κB、NFAT转录活性,细胞经不同处理后分为18组,分别为control组、S.uberis组、taurine 组、S.uberis+taurine 组、DMF 组、U 73122 组、U 73122+taurine 组、U 73122+S.uberis组、U 73122+S.uberis+taurine 组:FK 506 组、FK 506+taurine 组、FK 506+S.uberis组、FK 506+S.uberis+taurine组;RO 31-8220 组、RO 31-8220+taurine组、RO 31-8220+S uberis组、RO 31-8220+S.uberis+taurine 组:首先流式细胞术检测S.uberis 0140J 与MAC-T共孵育后MAC-T中Ca2+和ROS的含量变化:然后利用ELISA试剂盒检测细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的蛋白水平;最后化学试剂盒检测细胞损伤指标(NAGase、LDH 活性)。研究结果显示:感染 3 h 后,U 73122、RO 31-8220、FK 506的感染组与S.uberis 0140J感染组相比MAC-T内的Ca2+浓度显著降低(P<0.05);与U 73122、RO 31-8220、FK 506的S.uberis 0140J感染组相比,添加牛磺酸后,MAC-T内的 Ca2+浓度显著降低(P<0.05)。感染 4h 后,U 73122、RO 31-8220、FK 506 感染组内的MAC-T的ROS含量、上清中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平、NAGase活性与LDH活性显著降低(P<0.05);添加牛磺酸后,MAC-T内的ROS含量、上清中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平、NAGase活性与LDH活性进一步明显的降低(P<0.05)。研究结果表明:利用抑制剂抑制Ca2+动员或抑制NF-κB、NFAT转录活性可降低因S.uberis 0140J感染引起的MAC-T内Ca2+浓度、ROS含量、炎症因子的分泌及细胞培养上清中的NAGase、LDH的活性的升高;牛磺酸的添加能够进一步的降低Ca2+浓度、ROS含量、炎症因子的分泌及细胞培养上清中的NAGase、LDH的活性;这些结果与上面的结果相一致,为牛磺酸通过肌醇磷脂/Ca2+信号介导的炎症通路抗S.uberis 0140J感染的机制提供补充。