【摘 要】
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根瘤菌可与豆科植物形成共生系统,这种共生关系的建立涉及豆科植物与根瘤菌之间的信号传导与基因表达调控,而基因表达调控与蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用有着紧密联系。为了分析与研究转录调控因子与基因启动子的相互作用,本文利用细菌单杂交系统构建了7653R全基因组随机DNA文库。同时,根据转录组分析的结果,选择其中一个感兴趣的上调表达基因MCHK＿8182,构建了该基因的双交换突变体,并通
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根瘤菌可与豆科植物形成共生系统,这种共生关系的建立涉及豆科植物与根瘤菌之间的信号传导与基因表达调控,而基因表达调控与蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用有着紧密联系。为了分析与研究转录调控因子与基因启动子的相互作用,本文利用细菌单杂交系统构建了7653R全基因组随机DNA文库。同时,根据转录组分析的结果,选择其中一个感兴趣的上调表达基因MCHK＿8182,构建了该基因的双交换突变体,并通过盆栽检测共生固氮表型。取得了如下实验结果。其一是7653R全基因组随机DNA文库的构建和初步筛选。抽提华癸中慢生根瘤菌7653R全基因组DNA,利用Sau3AI进行部分酶切,回收主带为1.5Kb-2.5Kb的DNA片段。利用同尾酶Bam HI对p B1H2W5载体进行酶切,利用热敏磷酸酶对线性化的p B1H2W5载体进行去磷酸化。然后将部分酶切的回收DNA片段与去磷酸化处理后的p B1H2W5载体进行连接、转化大肠杆菌DH5α。结果获得3.6×10~4个原始文库克隆子,检测了克隆子的随机插入片段大小。根据Clarke-Carbon公式进行计算,表明该文库以99.9%的概率覆盖7653R全基因组。使用p H3U3-bac Ap作为诱饵,对文库进行了筛选,并获得一个Rr F2家族蛋白MCHK＿2802。其二是MCHK＿8182双交换突变体的构建和共生固氮表型检测。我们设计了重叠延伸PCR引物,构建MCHK＿8182置换载体。通过三亲本杂交将突变载体导入到7653R中并将转化菌株置于蔗糖压力培养下进行筛选,最终获得MCHK＿8182双交换突变株,测序验证双交换突变株正确。盆栽实验的结果显示,与7653R野生型接种的植株相比,MCHK＿8182突变菌株接种的植株根瘤数减少,但固氮酶活未见明显差异。华癸中慢生根瘤菌7653R细菌单杂交随机文库的建立,为后续筛选、鉴定和研究转录调控因子功能奠定了良好的工作基础;同时,MCHK＿8182突变体的构建为深入研究根瘤菌的细胞色素P450提供了新的研究材料。
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