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土壤重金属污染是全球性问题,严重影响人类健康、作物产量和生态安全。植物修复是一种环境友好的土壤修复技术,可以改善土壤中重金属污染。植物修复中的植物提取-植物吸收重金属并将其运输到植物的组织中的地上部分-是减少土壤中重金属总量的最环保的方法,具有广泛的应用前景。超富集植物或具有生物质的高吸附转基因植物是植物提取的重要生物材料。近年来进行的植物修复的科学努力和实践表明,通过针对HMA及Nramp转运蛋白家族的转基因技术创建高吸附植物是植物修复重金属污染土壤的有力途径。在以往研究中,来自超富集植物伴矿景天Sedum pumbizincicola的三种不同的金属转运蛋白SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6被证实具有Cd转运能力。SpHMA2和SpNramp6位于质膜上,SpHMA3位于液泡膜上。重金属Cd、Pb、Cu、Zn和Mn的处理都可以强烈刺激它们的表达。为了创造潜在的植物提取生物材料,我们实验室在具有高生物量和环境适应性的K407油菜中过表达了三个单基因SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6,以及两个组合基因SpHMA2＆SpHMA3和SpHMA2＆SpNramp6,发现幼苗期的这些转基因工程油菜转运Cd和在地上部分积累Cd的能力都优于野生型油菜。并且,在混合Cd、Pb、Cu、Zn和Mn重金属污染的土壤中转基因油菜各株系的地上部分每种重金属的积累都得到了加强。这些结果为转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜成功的成为Cd和多种重金属污染土壤的植物提取材料提供了重要依据。基于以上研究成果,本研究通过分子和生理试验相结合的方法初步分析了转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜的遗传稳定性及环境安全性。取得具体研究成果如下:1.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜目的基因具整合稳定性。通过特异性PCR技术,对转基因工程油菜各株系T1-T3代的遗传物质进行了针对主要功能元件SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因的检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示在SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因对应bp长度区间有明显条带。并且,通过TAILPCR技术,对转基因工程油菜基因组的T-DNA插入位置的左侧和右侧的侧翼序列进行了扩增,并用高通量测序技术和BLAST技术对扩增片段进行了测序和油菜基因组碱基序列比对,成功找到了插入位置,因此可知外源基因SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6已经成功整合进入油菜基因组并能在不同时代中稳定遗传。2.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜目的基因具有表达稳定性。通过实时定量PCR技术,对T1-T3代转基因油菜的外源基因SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6进行了相对表达水平的测定,结果显示SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因在三个世代转基因油菜各株系中都有十数倍至千倍的表达,说明SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因在转基因油菜各株系中稳定表达。3.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜具有Cd等重金属吸附性状稳定性。测定高浓度Cd处理后野生型和T2代转基因油菜各株系单位重量的Cd含量,发现SpHMA2-OE1/OE3、SpHMA3-OE33/OE34、SpNramp6-OE1、SpHMA2＆SpHMA3-OE2和SpHMA2＆SpNramp6-OE4/OE5株系有较好的地上部分吸附Cd或转运Cd的能力。测定低浓度Cd处理盛花期土培野生型和T2代转基因油菜各株系中地上部分单位重量的Cd含量,发现除了SpNramp6-OE4外转基因油菜各株系均具有Cd高吸附能力。用激光共聚焦观察Cd处理后野生型和T3代转基因工程油菜的根、茎和叶的荧光探针强度得知转基因工程油菜地上部分的荧光强度更高,直观表明转基因工程油菜会向上转运Cd。用FE-SEM和EDAX仪分析多种重金属混合处理的野生型和T3代转基因油菜的根、茎和叶的横截面中的重金属含量,发现转基因油菜茎和叶中含量更高,初步判断转基因油菜可协同吸附Cd等多种重金属,表明这些转基因油菜具有Cd等重金属吸附性状稳定性。4.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜生存竞争力与野生型相同。通过测定和评价野生型和T3代转基因油菜的种子萌发率和出苗率、花粉活力以及其他综合农艺性状,发现转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜在污染土壤中的传播方式和传播能力以及综合农艺性状与野生型没有区别,表明转基因过程没有影响工程油菜的生存竞争力。5.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜靶标基因不发生基因漂移,具有环境安全性。通过特异性PCR检测技术,对盛花期转基因油菜田周围3km的杂草的遗传物质进行了针对目标基因SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6的检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示在SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因对应bp长度区间并没有显示目标条带,说明转基因工程油菜靶标基因向环境中其他植物发生转移的可能性较小。6.转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜并不会影响田间生物的多样性。记录转基因工程油菜周围农田中昆虫数量和种类以及杂草的质量和数量相比野生型没有区别,初步判断转基因工程油菜不会改变田间生物的种群和数量,进一步说明其环境安全性。综上所述,研究证明外源基因SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6已经稳定的整合在K407油菜基因组中,可以稳定有效的转运和吸附Cd以及多种混合重金属。在环境安全性方面,转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜的传播方式和传播能力没有改变,其生长状态、生命周期和适应性也没有发生变化,其标靶基因向其他植物发生转移的可能性较小,且不会改变田间生物的种群和数量。因此,转SpHMA2、SpHMA3和SpNramp6基因工程油菜遗传稳定且环境友好,可以推广作为土壤重金属污染条件下的植物修复材料。