【摘 要】
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DNA是人类以及大部分动植物的遗传物质,DNA碱基序列中存储的遗传信息,经过转录和翻译,形成蛋白质,并参与调控机体的各项生命活动。基因突变和DNA的表观遗传修饰都会对上述转
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DNA是人类以及大部分动植物的遗传物质,DNA碱基序列中存储的遗传信息,经过转录和翻译,形成蛋白质,并参与调控机体的各项生命活动。基因突变和DNA的表观遗传修饰都会对上述转录、翻译等基因表达过程产生直接或间接的影响,进而影响生物体的正常生长发育。基因表达过程的失调与某些人类常见疾病的发生有着千丝万缕的关联。因此,直接检测与疾病相关的基因突变及表观遗传修饰有非常重要的生命科学和病理学意义。我们通过连接反应对单碱基差异优异的识别能力,结合高效的核酸扩增技术,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),实现了对单碱基突变以及哺乳动物体内5-羟甲基胞嘧啶的分析,为生命科学的分子机理研究以及生物医学诊断提供了一种可供参考的检测方法。DNA序列上单个碱基的突变可能会导致其编码的蛋白质的生物功能发生变化,从而影响机体的正常生长发育,因此,建立灵敏度高、特异性好的单碱基突变检测方法十分必要。我们以KRAS基因外显子上的单碱基突变为研究对象,利用循环连接-PCR,实现了对单碱基突变的检测,该方法最低能够检测到10 aM的突变型目标序列。但是,与现有的单碱基突变检测手段相比,该方法的灵敏度和检测限还有待进一步发展。DNA的表观遗传修饰主要是指胞嘧啶5位碳原子的修饰,包括甲基化修饰、羟甲基化修饰等,其产物分别称为5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine,5-mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5-Hydroxymethylcytosine,5-hmC)。去甲基化过程是体内自发进行的一种调控过程,调节细胞的正常生长发育。而5-hmC作为去甲基化过程的动态标志物,是该领域研究的热点之一。除此之外5-hmC也独立发挥着重要的生物功能,参与基因表达的调控。因此,5-hmC灵敏度高、特异性好的研究方法的建立也是现阶段亟待解决的问题之一。在本文中我们针对5-hmC与5-mC和C难以区分的问题,整合酶切消化、KRu04氧化、亚硫酸盐处理等手段,将这三种胞嘧啶的区分问题转化成单碱基差异的区分,进而通过连接-LAMP反应体系,建立了一种高灵敏度,高特异性的5-hmC检测方法。该方法对5-hmC检测的线性范围跨越7个数量级,并且,浓度在10 fM以下的含有C和5-mC的目标序列对5-hmC的检测几乎没有影响,我们在总浓度为10 fM的5-hmC和C以及5-hmC和5-mC的混合体系中,成功检测到1%的5-hmC的存在。我们将该方法成功应用到了鼠脑基因组5-hmC含量分析。
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