【摘 要】
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植物丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,在植物非生物胁迫、生物胁迫、生长和发育等方面发挥重要功能。植物自交不亲和（Self-incompatibility,SI）是指植物拒绝自我花粉,只接受异我花粉的信号识别授粉机制。本论文以北方重要的观赏和食用性植物羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.ac
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（31870300）； 中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572018BD01）；
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植物丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,在植物非生物胁迫、生物胁迫、生长和发育等方面发挥重要功能。植物自交不亲和（Self-incompatibility,SI）是指植物拒绝自我花粉,只接受异我花粉的信号识别授粉机制。本论文以北方重要的观赏和食用性植物羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala）作为实验材料开展研究,RT-PCR分离羽衣甘蓝柱头BoMAPK4基因,进行序列分析;利用原核表达纯化获得BoMAPK4蛋白并制备多克隆抗体,用于Western blot分析羽衣甘蓝各组织蛋白表达量及授粉后蛋白表达变化;通过酵母双杂交系统和萤火素酶互补实验（Luciferase Complementation Assay,LCA）分析BoMAPK4与SI相关的调控蛋白SRK、ARC1的相互作用;最后通过U0126抑制处理实验及MAPK4硫代磷酸酯反义寡核苷酸抑制（Anti-sense Oligonucleotide Inhibition,AS-ODN）实验分析BoMAPK4在授粉方面的作用。主要获得的研究结果如下:（1）通过RT-PCR获得BoMAPK4,BoMAPK4开放阅读框长1122 bp,编码373个氨基酸,具有丝氨酸/苏氨酸结构域,无信号肽和跨膜结构。通过进化树分析和序列比对发现羽衣甘蓝BoMAPK4与油菜（Brassica napus）Bn MAPK4、芜菁（Brassica rapa）Br MAPK4、拟南芥（Arabidopsis thaliana）At MAPK4的氨基酸序列一致性分别为99.7%、99.5%、95.4%,表明羽衣甘蓝BoMAPK4在物种中高度保守。（2）将BoMAPK4编码区序列构建到原核表达载体p ET-14b上,转化到BL21（DE3）大肠杆菌中,通过IPTG诱导进行原核表达。SDS-PAGE结果显示,在分子量大小约45 k Da处有BoMAPK4蛋白特异性表达,利用亲和层析的方法获得高纯度的BoMAPK4蛋白。（3）利用获得的BoMAPK4蛋白免疫小鼠,制备BoMAPK4的多克隆抗体并检测特异性良好。提取羽衣甘蓝萼片、花瓣、花药、柱头、花柱、子房的总蛋白,通过Western blot进行蛋白表达量检测,结果发现BoMAPK4在花瓣、花药和子房中表达的较少,在萼片和花柱中表达的较多,在柱头中的表达量最高。对亲和授粉（Compatible pollination,CP）后60 min的柱头和自交不亲和授粉（SI）后60 min的柱头进行BoMAPK4的表达量分析,结果发现在60 min时亲和授粉柱头BoMAPK4的表达量上升,不亲和授粉柱头BoMAPK4表达量下降。（4）构建p Myr-BoMAPK4、p GADT7-BoMAPK4、Nluc-SRK910、Nluc-SRK13b、Nluc-Bo ARC1和Cluc-BoMAPK4载体,酵母双杂交结果发现,在细胞质内BoMAPK4与SRK910、SRK13b和Bo ARC1无相互作用,在细胞核内与Bo ARC1具有相互作用。LCA结果观察到BoMAPK4与Bo ARC1的相互作用荧光信号。（5）对羽衣甘蓝自交不亲和系(S13-bS13-b)柱头通过U0126抑制处理后进行自交不亲和及异交亲和授粉,苯胺蓝染色结果发现,加入U0126后SI授粉的花粉粒和花粉管数目无明显变化,亲和授粉的花粉粒和花粉管数量明显减少。（6）设计羽衣甘蓝MAPK4的硫代硫酸酯寡核苷酸特异性修饰序列（Oligodeoxynucleotide,ODN）,对羽衣甘蓝自交不亲和系(S13-bS13-b)柱头通过S-ODN（对照）及AS-ODN（抑制MAPK4的特异性序列）孵育培养4 h后,将其分别进行亲和授粉及不亲和授粉,通过苯胺蓝染色观察到通过AS-ODN孵育后的柱头,在亲和授粉时花粉粒黏附和花粉管萌发数量明显减少,而在不亲和授粉时没有明显变化。
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