【摘 要】
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Mdfic（MyoD family inhibitor domain containing）基因，是一个近年新发现的基因，其编码I-mfa结构域，但其功能研究尚属空白。本实验室的前期研究初步证实Mdfic蛋白与Rhox5蛋白间的相互作用，暗示Mdfic蛋白有可能是与Rhox5蛋白组成转录调控复合体，共同参与胚胎发育过程中的分化调控。为了进一步研究Mdfic蛋白的功能，利用原核表达系统表达并纯化Md
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Mdfic（MyoD family inhibitor domain containing）基因，是一个近年新发现的基因，其编码I-mfa结构域，但其功能研究尚属空白。本实验室的前期研究初步证实Mdfic蛋白与Rhox5蛋白间的相互作用，暗示Mdfic蛋白有可能是与Rhox5蛋白组成转录调控复合体，共同参与胚胎发育过程中的分化调控。为了进一步研究Mdfic蛋白的功能，利用原核表达系统表达并纯化Mdfic重组蛋白，制备其特异性多克隆抗血清，为Mdfic的功能研究奠定基础。目的：构建pGEX-4T-3-Mdfic重组表达质粒，在大肠杆菌中诱导表达GST-Mdfic蛋白，纯化GST-Mdfic蛋白，制备其特异性多克隆抗血清，定位Mdfic的亚细胞分布研究，定量小鼠各主要组织器官中Mdfic的表达水平。方法：生物信息学分析Mdfic基因序列；设计引物，PCR扩增Mdfic全长cDNA序列，并将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-3，构建成pGEX-4T-3-Mdfic重组表达质粒；转化大肠杆菌表达菌株BL21，IPTG诱导表达GST-Mdfic融合蛋白，亲和纯化GST-Mdfic蛋白；以纯化后的GST-Mdfic蛋白为抗原，皮内注射免疫雄性新西兰兔制备Mdfic蛋白的特异性多克隆抗血清，ELISA测定其效价，Western Blotting检测其特异性；免疫荧光检测Mdfic的亚细胞分布；荧光定量PCR方法检测小鼠各组织器官中Mdfic mRNA的表达水平。结果：Mdfic的生物信息学分析表明：Mdfic基因可能是HIC（Human I-mfa domain containing protein）的鼠基因类似物，同属于I-mfa结构域家族，推测I-mfa结构域在Mdfic蛋白的功能发挥中发挥重要作用；成功构建pGEX-4T-3-Mdfic重组表达质粒，IPTG诱导获得GST-Mdfic的高效表达；亲和纯化GST-Mdfic蛋白并对其超滤除盐；获得Mdfic蛋白的特异多克隆抗血清，ELISA测定抗血清效价约为1∶640000，Western Blotting表明该多克隆抗血清能特异识别结合内源性及外源性Mdfic蛋白；间接免疫荧光实验表明Mdfic在细胞中遍在分布，其中以细胞质为主；荧光定量PCR显示Mdfic在成鼠肝、脾、肾、睾丸中高表达。结论：成功制备获得高效价、高特异性的Mdfic多克隆抗血清；定位Mdfic蛋白的亚细胞分布并指出成鼠不同组织器官组织中Mdfic RNA的表达量存在差异，为Mdfic的功能研究奠定基础。
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