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目的糖尿病易引发全身多种器官发生病变,牙周炎是其并发症之一,牙周炎炎症程度越重,越不利于血糖控制,本实验拟通过建立SD大鼠动物模型探索牙周炎对2型糖尿病大鼠胰腺组织自噬的影响,并通过自噬抑制剂3-MA、自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin,Rapa)对经典自噬信号通路PI3K/Akt/m TOR进行调控,探讨牙周炎是否通过PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导2型糖尿病大鼠胰岛细胞的过度自噬。为临床中寻找糖尿病伴牙周炎疾病的治疗奠定新的理论和实验依据。方法1、100只SPF级6周龄SD雄性大鼠随机分为4组,实验分组如下:(1)对照组(C组,10只);(2)糖尿病模型组(DM组,40只);(3)牙周炎模型组(CP组,10只);(4)牙周炎伴糖尿病模型组(DM+P组,40只);C组、CP组以普通饲料喂养,DM组和DM+P组以高脂高糖饲料喂养6周后,腹腔注射1%链脲佐菌素(streptozocm,STZ)35 mg/kg,以空腹血糖≥11.1 mmol/L作为2型糖尿病大鼠成模标准。2型糖尿病模型成模后开始诱导牙周炎模型,CP组、DM+P组用丝线结扎双侧上颌第一、第二磨牙牙颈部,共8周。实验期间定期监测各组大鼠空腹血糖及体重的变化,第14周末各组大鼠麻醉处死10只。HE染色观察各组大鼠上颌牙槽骨及胰腺组织的病理学变化;Micro-CT扫描观察牙槽骨吸收情况;ELISA检测大鼠血清TNF-α,IL-1β,IL-6的表达;RT-q PCR检测胰腺组织中胰岛素分泌相关基因:葡萄糖激(glucokinase,GCK)、解偶联蛋白-2(uncoupling protein-2,UCP-2)、葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter 2,GLUT-2)以及自噬相关基因LC3II、Beclin1m RNA的相对表达量;Western Blot检测自噬相关蛋白LC3II/LC3I、Beclin1的蛋白表达量。2、第14周末,即牙周炎模型建立成功后,DM+P组大鼠去除结扎丝线,DM组、DM+P组再分别用自噬激活剂Rapa与自噬抑制剂3-MA对PI3K/Akt/m TOR信号通路进行调控,分组如下:(1)DM组;(2)DM+3-MA组;(3)DM+Rapa组;(4)DM+P组;(5)DM+P+3-MA组;(6)DM+P+Rapa组;10只/组,DM+3-MA组、DM+P+3-MA组腹腔注射1.5mg/(kg·d)3-MA;DM+Rapa组、DM+P+Rapa组腹腔注射1.0mg/(kg·d)Rapa,均连续注射4周,DM组及DM+P组不予处理,第18周末处死各组大鼠取胰腺组织进行相关检测。Western Blot检测PI3K/Akt/m TOR信号通路相关蛋白表达量以及自噬相关蛋白的表达量;RT-q PCR检测胰岛细胞胰岛素分泌相关基因的相对表达量。结果(1)体重变化:第6周时,即高脂高糖喂养6周后,与C组比较,CP组体重无显著性差异(P>0.05),DM组、DM+P组体重上升(P<0.05);第14周时,即牙周炎模型造模成功后,与C组比较,CP组体重呈下降趋势(P>0.05),DM组与DM+P组体重降低(P<0.05),且DM+P组降低更为显著(P<0.05)。(2)空腹血糖变化:STZ注射后一周,与C组比较,DM组及DM+P组空腹血糖升高(P<0.05);第14周时,与C组比较,CP组空腹血糖无显著性差异(P>0.05),DM组和DM+P组空腹血糖显著升高(P<0.05),且DM+P组高于DM组(P<0.05)。(3)Micro-CT显示:与C组比较,CP组、DM+P组牙槽骨吸收较明显,根分叉暴露,且DM+P组最严重,说明牙周炎动物模型建立成功。(4)上颌牙槽骨HE染色显示:与C组相比,CP组、DM+P组牙周袋形成,胶原纤维破坏,结合上皮向根方迁移,牙槽骨吸收,DM+P组最为明显,进一步验证牙周炎动物模型建立成功。(5)胰腺HE染色结果显示:与C组相比,DM组、DM+P组胰岛内细胞排列不均、炎性细胞浸润、胰岛体积变小等病理性改变,且DM+P组病理改变更为严重。(6)ELISA检测结果:与C组相比较,DM组、CP组与DM+P组血清IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平依次增加(P<0.05);与DM组比较,CP组和DM+P组炎性细胞因子表达均升高(P<0.05),且DM+P组水平较CP组更高(P<0.05)。(7)RT-qPCR结果显示:与C组比较,CP组GCK、GLUT-2m RNA相对表达量呈下降趋势(P>0.05),DM+P组、DM组基因相对表达量均下降(P<0.05),且DM+P组低于DM组(P<0.05);与C组比较,CP组UCP-2、Beclin1、LC3II m RNA表达量无显著性差异(P>0.05),DM+P组、DM组m RNA表达量增加(P<0.05),且DM+P组高于DM组(P<0.05)。(8)Western Blot检测结果:与C组比较,CP组自噬蛋白Beclin1、LC3II/LC3I比值呈上升趋势(P>0.05),DM组及DM+P组表达升高(P<0.05),且DM+P组表达量高于DM组(P<0.05)PI3K/Akt/m TOR信号通路调控情况:(1)Western Blot结果显示:(1)DM+3-MA组及DM+P+3-MA组分别与DM组及DM+P组比较,PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白PI3K、p-Akt/Akt比值、p-m TOR/m TOR比值及自噬蛋白Beclin1、LC3II/LC3I表达量均较低(P<0.05);DM+P+3-MA组通路蛋白比DM+3-MA组表达量更低(P<0.05),但自噬蛋白表达量升高(P<0.05)。(2)DM+Rapa组及DM+P+Rapa组分别与DM组及DM+P组比较,通路蛋白PI3K、p-Akt/Akt比值及自噬蛋白Beclin1、LC3II/LC3I的表达均升高(P<0.05),而p-m TOR/m TOR比值的表达量降低(P<0.05);DM+P+Rapa组通路蛋白比DM+Rapa组表达量更低(P<0.05),但自噬蛋白表达量升高(P<0.05)。(2)RT-qPCR结果显示:DM+P+3-MA组及DM+P+Rapa组分别与DM+3-MA组及DM+Rapa组比较,胰岛素分泌相关基因GCK、GLUT-2m RNA表达量降低(P<0.05),UCP-2m RNA表达量增加(P<0.05)。结论1、牙周炎可能促进2型糖尿病大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β炎性细胞因子的表达增加。2、牙周炎可能加剧破坏2型糖尿病大鼠胰岛细胞分泌胰岛素的功能。3、牙周炎可能诱导2型糖尿病大鼠胰岛细胞过度自噬。4、牙周炎可能通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路的活性导致2型糖尿病大鼠胰岛细胞过度自噬,加速破坏2型糖尿病大鼠胰岛细胞分泌胰岛素的功能。