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研究背景及目的骨肉瘤(Osteosarcoma OS)是一种从间叶细胞发展而来的骨癌,在我国多发生于15-25岁,多见于长骨的干骺端,如股骨的远端、胫骨的近端。骨肉瘤常通过局部浸润、血行转移而较早发生远处转移,以肺部转移最为常见,从而导致部分患者于就诊时已发生肺转移,这也是骨肉瘤预后差的主要原因之一。早期受科学技术发展的限制,医学上对于骨肉瘤的治疗以手术截肢为主流,五年生存率不足20%,且截肢后严重影响患者的外观及肢体功能,对患者的心理也是一种极大的伤害。随着科学技术的进步及医学多模式治疗理念的引入,目前骨肉瘤的治疗以术前新辅助化疗-手术治疗-术后新辅助化疗为主;自引入化疗以来,骨肉瘤患者的保肢率明显提高,5年生存率也提高至70%,同时也提高了患者的生活质量。然而,骨肉瘤的亚型高达十余种,且目前对于骨肉瘤发生发展的病理机制尚无定论,因此即使通过研发新型化疗药物或者采用多种化疗药物联合应用的方法也很难做到对骨肉瘤各亚型的精准治疗,再者长期的化疗增加了骨肉瘤细胞耐药的可能性。对于骨肉瘤的治疗仿佛进入到一个瓶颈期。随着对骨肉瘤发病分子机制研究的深入,人们认识到可以通过探寻与骨肉瘤转移与复发相关的分子位点,并对其进行分子干预,达到抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭、转移的目的,从而为骨肉瘤的治疗开拓了新的治疗思路。组织蛋白酶B(CB)是一种与木瓜蛋白酶结构相似的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。最新研究发现,组织蛋白酶B可在恶性肿瘤的各个阶段起到不同的作用,并且在多种肿瘤细胞中均呈现高表达,如胃癌、肺癌、口腔鳞癌、食管癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌等。然而对于组织蛋白酶B在分子学上如何影响骨肉瘤发生发展的报道较为罕见。因此我们通过构建抑制组织蛋白酶B基因表达的抑制物,探究组织蛋白酶B对骨肉瘤细胞增殖、浸润、迁移等细胞功能学的影响,进一步揭示骨肉瘤转移与复发的分子机制,为骨肉瘤的治疗提供新的作用靶点。本实验通过购买骨肉瘤患者的肿瘤组织及癌旁组织标本,研究骨肉瘤组织及癌旁组织中组织蛋白酶B蛋白表达的差异性。并观察沉默组织蛋白酶B后MG63细胞增殖、迁移及侵袭的改变,以探讨组织蛋白酶B对骨肉瘤细胞功能的影响。方法1.利用免疫组化技术观测骨肉瘤组织及癌旁组织中组织蛋白酶B表达的差异。2.利用脂质体2000转染法将特异性沉默组织蛋白酶B基因的小干扰RNA(siRNA)瞬时转染进骨肉瘤MG63细胞中。实验分组如下:(1)Blank组:只转染入脂质体试剂;(2)siRNA-1组:转染CB-siRNA-1;(3)siRNA-2组:转染CB-siRNA-2;(4)siRNA-3组:转染CB-siRNA-3;(5)NC组:转染negative control-siRNA。3.利用免疫印迹(Western blot)实验方法检测各组在转染后组织蛋白酶B表达的差异,并从siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组挑选出沉默效率最高者作为后续实验组。4.利用CCK-8实验及克隆形成实验,检测各组MG63细胞增殖情况,分析各组细胞的增殖能力是否存在差异。5.利用细胞划痕实验,检测各组MG63细胞的迁移情况,分析各组细胞的迁移能力是否存在差异。6.通过Transwell实验,检测各组MG63细胞的侵袭情况,分析各组细胞的侵袭能力是否存在差异。结果1.骨肉瘤组织与癌旁组织相比,组织蛋白酶B的表达明显升高。2.siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组均可显著下调骨肉瘤MG63细胞中组织蛋白酶B的表达,与NC组及Blank组相比P<0.001。且siRNA-2组下调效果最为明显,其与siRNA-1组、siRNA-3组相比P<0.05。因此将siRNA-2组作为后续实验组。3.CCK-8实验中siRNA-2组与Black组相比,其450nm波长吸光度值(OD450值)在24h、48h、72h均明显降低,P均小于0.05,而在0h、96h差异无统计学意义(P>0.05)。4.单克隆形成实验中,siRNA-2组细胞克隆形成数明显低于Blank组及NC组(P<0.001),Blank组与NC组之间无明显差异(P>0.05)。5.细胞划痕实验表明,siRNA-2组细胞愈合率在6h明显低于Blank组及NC组(P<0.01),在12h细胞愈合率也明显低于Blank组及NC组(P<0.001)。Blank组与NC组相比细胞愈合率在6h及12h均无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。6.Transwell实验表明,siRNA-2组中穿过小室基底膜的细胞与Blank组及NC组相比明显减少,差异有统计学意义(P<0.001)。Black组与NC组相比,穿过小室基底膜的细胞数相差不大,无统计学意义(P>0.05)。结论1.骨肉瘤组织中组织蛋白酶B的表达明显增高。2.组织蛋白酶B具有增强骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力的作用。