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幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是胃炎、胃十二指肠溃疡及胃癌等疾病的重要危险因素。有效的疫苗接种将是在人群水平上预防和控制Hp感染的重要途径。在抗 Hp 感染免疫应答中，Hp 中性粒细胞激活蛋白 A （neutrophil-activating protein A,NapA）和黏附素A(adhesin A,HpaA)发挥重要作用，是目前Hp疫苗研究中两种重要的候选抗原。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L. lactis）目前已被广泛地用作疫苗载体，用于抗原蛋白的表达和递送。 目的 用L. lactisNZ3900/pNZ8149食品级表达载体分别构建表达HphpaA和napA基因的重组菌株，经小鼠免疫实验鉴定其免疫保护效果，并初步探讨其免疫保护机制，以促进Hp口服疫苗的研发。 方法 1. 应用基因重组技术构建 L. lactis 基因重组菌株 NZ3900/pNZ8149-hpaA 和NZ3900/pNZ8149-napA，用nisin诱导表达HpaA和NapA蛋白，蛋白的免疫反应性通过SDS-PAGE和Western blotting法鉴定。 2. SPF级BALB/c小鼠按体重随机分为HpaA组、NapA组、HpaA+NapA组、8149组、GM17组和基线组，前五组分别用200 μLNZ3900/pNZ8149-hpaA菌液（含1×1010CFUs）、NZ3900/pNZ8149-napA菌液（含1×1010 CFUs）、混合菌液（含两种工程菌各1×1010CFUs）、NZ3900/pNZ8149（含1×1010 CFUs）、无菌GM17培养基灌胃，每周一次共免疫 6 次。这五组均在末次免疫一周后随机处死二分之一数量的小鼠，收集血清和粪便样品，抗原特异性IgG和SIgA抗体通过ELISA法检测；分离并培养脾脏细胞，并用 Hp 全菌抗原刺激细胞，用 ELISA 法检测培养物上清中Th1、Th2和Th17型免疫反应相关细胞因子。对基线组不进行灌胃处理。 3.末次免疫2周后，用Hp 11637菌液（含菌体2×109CFUs）经灌胃攻击感染小鼠（基线组除外），每隔2天攻击一次，共4次。所有小鼠均在末次攻击感染一周后处死，用尿素酶试验和qPCR法检测胃组织中Hp的定植。 4. 取各重组菌过夜培养的菌液，按照1:25的比例加入不含nisin的GM17液体培养基中，连续培养12 h，期间每60 min测定一次OD600值，横坐标为培养时间，纵坐标为 OD600，绘制其生长曲线。用同样的方法测定重组菌株在含 nisin （终浓度25 ng/mL）的GM17培养基中的生长曲线。测定重组菌在无抗生素筛选压力的条件下连续培养至第50代时，携带重组质粒的菌体阳性率。用平板计数法测定不同 OD600值的重组菌株菌液所对应的菌落数，用 Matlab 软件分析OD600与CFU/mL关系。 结果 1. 经 PCR、酶切及测序鉴定证实，重组菌株 NZ3900/pNZ8149-hpaA 和NZ3900/pNZ8149-napA 构建正确。SDS-PAGE 分析显示，诱导表达的HpaA 和NapA的分子量分别约为27kDa和15kDa，表达量分别约占菌体总蛋白的33.3%和18.6%。Western blotting显示HpaA和NapA均可被小鼠抗Hp免疫血清识别。 2. 免疫接种后抗体检测：与 8149 组和 GM17 组相比，HpaA 组、NapA 组和HpaA+NapA组的抗原特异性IgG和SIgA抗体均升高（P＜0.05）；HpaA+NapA组抗HpaA的IgG抗体明显高于HpaA组（P＜0.05），但与NapA组相比抗NapA的IgG抗体差异无统计学意义（P＞0.05）；HpaA+NapA组抗HpaA SIgA抗体较HpaA组低，抗NapA的SIgA抗体较NapA组低（P＜0.05）。 3. 细胞因子检测：(1)与 8149 组和 GM17 组相比，HpaA 组、NapA 组和HpaA+NapA组的IL-17、IL-23、IFN-γ水平均升高，NapA组的IFN-γ水平高于HpaA组和HpaA+NapA组（P＜0.05）；(2) IL-2: HpaA+NapA组高于8149组和GM17组，HpaA组高于GM17组（P＜0.05）；(3) IL-12：HpaA组、NapA组高于 8149 组和 GM17 组，HpaA+NapA 组高于 GM17 组（P＜0.05）；(4) IL-4：HpaA+NapA组低于8149组和GM17组，HpaA组、NapA组低于8149组（P＜0.05）；(5) IL-10:HpaA组、NapA组和HpaA+NapA组的IL-10水平均低于8149组（P＜0.05）。 4. Hp定植检测：尿素酶试验结果显示，HpaA组、HpaA+NapA组的OD550均低于GM17组和8149组，NapA组的OD550低于GM17组（P＜0.05）；qPCR结果显示HpaA组、NapA组和HpaA+NapA组均低于8149组，HpaA+NapA组低于HpaA 组（P＜0.05）；但 HpaA+NapA 组与 NapA 组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。 5.细菌传代实验结果显示，L. lactis重组菌株传代至第50代，从随机挑取的50个单菌落中，用PCR方法均可检测到质粒携带的目的基因，阳性率为100%。通过测量不同培养时间的L. lactis重组菌菌液的OD600值和菌体浓度，获得了重组菌株的生长曲线和菌液OD600值与CFU/mL的关系曲线。 结论 1. 应用食品级乳酸菌表达系统和基因工程技术成功地构建了分别表达Hp HpaA和NapA的重组菌株L. lactisNZ3900/pNZ8149-hpaA和L. lactisNZ3900/pNZ8149-napA；重组菌株表达的HpaA蛋白和NapA蛋白具有良好的免疫反应性。 2. 重组菌株单独或联合经口免疫小鼠，均可引起小鼠特异性血清 IgG 和肠道SIgA抗体的升高，诱导产生Th1和Th17型免疫反应；并可减少受Hp攻击的小鼠胃组织Hp的定植；NapA可增强HpaA的免疫保护效果。 3.重组L. lactis菌株具有较好的遗传稳定性；重组菌株的生长曲线和菌液OD600值与CFU/mL关系的研究将进一步推动工程菌株的应用。