Micro RNA（mi RNA）是一类长度约21-25nt的单链非编码RNA,具有高度保守性的特点,在靶基因转录后水平发挥诱导沉默的作用,调节生长、发育以及免疫应答等生物学过程。维生素D3是鱼类日粮饲料中不可或缺的物质,由于维生素D特殊的产生途径,大多数鱼类无法自身合成维生素D,必须依靠外源性添加才能维持机体正常的生长发育需求。各项研究表明,鱼类对于维生素D3具有很强的耐受性,并且,在饲料中添加维生素D3,能够增强鱼类的免疫能力和抗病能力,在抵抗病原微生物侵袭时降低死亡率。但是鱼体中的mi RNA能否响应日粮饲料维生素D3浓度的变化?响应了维生素D3的mi RNA如何在JAK-STAT这条免疫通路中调节免疫应答?本课题选择黄颡鱼幼鱼为主要研究对象,开展了为期12周的维生素D3营养调控养殖实验以及养殖实验结束后的鮰爱德华氏菌攻毒实验,对攻毒后的头肾脾脏组织进行高通量测序,筛选差异表达的mi RNAs,并对差异表达mi RNAs进行靶基因的生物信息学预测和富集分析以及验证,探讨维生素D3介导mi R-194a通过JAK-STAT信号通路调节免疫应答的机制。主要研究成果如下:1.不同浓度日粮维生素D3对组织mi RNA的影响为了探究哪些mi RNAs响应了不同浓度的日粮饲料维生素D3,我们设计了饲料组1维生素D3浓度为1120 IU/kg、饲料组2维生素D3浓度为3950 IU/kg、饲料组3维生素D3浓度为16600 IU/kg,高通量测序后发现饲料组2相对于饲料组1的黄颡鱼头肾脾脏组织中有5个共同出现的差异表达mi RNAs（mi R-194a、mi R-192、mi R-2188-3p、mi R-122、mi R-459-5p）,但是在饲料组3相对于饲料组1的头肾脾脏组织中未发现共同出现的差异表达mi RNA。对所有差异表达mi RNAs进行靶基因预测和富集,发现mi R-194a的靶基因富集在JAK-STAT信号通路中,根据以上结果,我们预测维生素D3能够介导mi R-194a通过JAK-STAT信号通路调节免疫应答,并在后续实验进行了验证。2.mi R-194a与JAK-STAT通路相关靶基因的验证通过mi RNA与靶基因预测软件预测了mi R-194a与靶基因jak2a和tyk2存在潜在的结合位点。为了确定mi R-194a是否能够调控jak2a和tyk2,我们通过克隆jak2a与tyk2结合位点的片段并将克隆片段与psi CHECK-2质粒构建野生型（WT）重组质粒,同时将结合位点的6个碱基突变为原始碱基的互补碱基,构建突变型重组质粒（MUT）。通过将mi RNA mimics、mi RNA NC与重组质粒共转染HEK-293T细胞后检测报告基因的荧光活性,最终鉴定出mi R-194a对靶基因jak2a和tyk2具有靶向性调控的关系,能够发挥对jak2a和tyk2的抑制作用。3.维生素D3介导mi R-194a通过JAK-STAT信号通路对免疫应答机制的探究通过体外巨噬细胞实验,在细胞中同样检测到mi R-194a可以响应培养基中不同浓度的活性维生素D3,并且对靶基因jak2a与tyk2同样发挥抑制作用;通过进一步对靶基因在JAK-STAT通路中的下游基因表达量的检测,我们发现随着JAK-STAT信号通路的激活,抗炎症反应（AIR）因子表达量随着培养基中维生素D3浓度升高呈现上升趋势（P＜0.05）,炎症通路NF-κB通路被抑制（P＜0.05）,并且调节了巨噬细胞由M1型极化向M2型极化的转变（P＜0.05）。综上所述,本研究证明了mi R-194a能在体内体外实验中响应维生素D3的变化,饲料维生素D3通过促进mi R-194a的表达,负调控靶基因jak2a和tyk2,并对JAK-STAT通路中的下游基因发挥间接作用,饲料维生素D3介导mi R-194a通过JAK-STAT信号通路调控了黄颡鱼的免疫应答。