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研究背景:胰腺癌是常见消化系统恶性肿瘤之一,由于其发病隐匿,致使多数患者错过最佳治疗时机。随着全球胰腺癌新增病例及死亡病例逐年增长,5年生存率低至10%左右。目前,其治疗方案仍以手术和化疗为主,但治疗效果收效甚微,仍未有效改善患者生存率及预后。因此,需要从更深入的角度探究其分子机制,为胰腺癌的诊治提供新方向。能量代谢重编程已被公认为在恶性肿瘤的发生与发展过程中扮演了重要角色。其中脂肪酸氧化（Fatty acid oxidation,FAO）作为新兴的研究热点,存在于大部分癌症恶性演进过程中。肉碱棕榈酰基转移酶1A（Carnitine Palmitoyl-teansferase 1A,CPT1A）作为肉碱系统家族成员之一,是FAO过程的关键限速酶,主要通过调控癌细胞内的FAO过程在癌症进展中起关键作用。NADPH醌氧化还原酶1（NAD（P）H:quinone oxidoreductase 1,NQO1）是一种普遍存在于哺乳动物器官中的可溶性黄素酶,可作为超氧化物还原酶,参与m RNA翻译的结合和调节,具有与蛋白质相互作用及降解蛋白酶体等功能。多年研究证实,NQO1可通过多种能量代谢途径来调控多种恶性肿瘤的演进,如乳腺癌、肺癌和肝癌等。本课题组前期已发现NQO1在胰腺癌中高表达及预后不良相关,但尚未深入探讨其在胰腺癌的生物学进程及分子机制。NQO1是否通过FAO参与胰腺癌演进及其与FAO过程中关键酶的关系尚未见报道,需进一步深究并剖明。研究目的:深入探究NQO1对胰腺癌细胞的生物学功能的影响,初步阐明NQO1与脂肪酸氧化关键酶CPT1A在调控胰腺癌脂肪酸氧化及其演进中的作用及其分子机制。材料与方法:1.NQO1与胰腺癌在数据库中相关性分析:1)通过探究GEPIA、TIMER2.0、ENCORI、UCSC Xena、UALCAN和Oncomine等数据库验证NQO1在胰腺癌中的表达情况;2)通过Oncolnc、HPA、GEPIA和Kaplan-Meier数据库进行生存分析;2.体外实验:1)构建稳定差异表达的NQO1稳转细胞系;2)应用MTT、平板克隆和Ed U对胰腺癌细胞增殖能力的影响;3)Transwell和划痕实验检测NQO1对胰腺癌细胞转移能力的影响;4)免疫荧光和蛋白免疫印记实验检测NQO1对胰腺癌细胞EMT进程的影响;5)挖掘STRING数据库和Linked Omics数据库富集分析预测NQO1在胰腺癌中的具体分子机制;6)应用FAO试剂盒、ATP试剂盒、蛋白免疫印记实验检测NQO1在胰腺癌脂肪酸氧化中的调控作用;7)使用ETX通过MTT、平板克隆、细胞划痕及蛋白免疫印记实验明确NQO1在胰腺癌中调控脂肪酸氧化的分子机制;8)通过Ch IPBase、GEPIA和TIMER数据库探究NQO1与CPT1A相关性并应用免疫组织化学染色验证CPT1A在胰腺癌组织中的表达情况,同时应用免疫荧光共定位和Co IP实验检测NQO1与CPT1A间互作关系;9)应用泛素化技术检测NQO1在CPT1A蛋白泛素化降解中的调控作用;10)应用慢病毒转染、平板克隆、细胞划痕、Transwell和蛋白免疫印迹等实验探究NQO1与CPT1A在胰腺癌脂肪酸氧化、增殖和转移中的作用及调控机制。3.体内实验:1)构建裸鼠皮下荷瘤模型,探究NQO1差异表达对胰腺癌增殖的影响;2)通过免疫组织化学染色实验对比NQO1、增殖标志物和脂肪酸氧化相关标志物在不同组别的小鼠皮下荷瘤组织中的表达变化。结果:1.NQO1在胰腺癌组织中表达上调,并与不良预后相关:通过检索数据库发现,NQO1在胰腺癌组织中高表达,且数据库中生存分析显示NQO1的高表达预示患者的不良预后;2.NQO1过表达与胰腺癌患者的淋巴结转移相关:通过HPA数据库和免疫组织化学实验显示,NQO1蛋白在胰腺癌组织中显著高于正常癌旁组织,并且主要定位于细胞核,少量表达于细胞质;对胰腺癌组织芯片的分析显示NQO1的表达仅与淋巴结转移相关（P＜0.05）;3.NQO1促进胰腺癌的增殖能力:通过MTT、平板克隆、Ed U、裸鼠皮下荷瘤种植及免疫组织化学染色检测小鼠皮下肿瘤组织中Ki67蛋白表达情况等实验发现,NQO1的过表达在体内与体外均可促进胰腺癌细胞的增殖,反之亦然;4.NQO1促进细胞迁移、侵袭能力及EMT进程:通过细胞划痕与Transwell小室实验表明NQO1过表达可促进胰腺癌细胞的迁移与侵袭能力;EMT相关蛋白免疫印迹、免疫组织化学染色和免疫荧光等实验发现,NQO1可调控胰腺癌细胞的EMT进程;5.NQO1通过脂肪酸氧化在胰腺癌进程中发挥促癌作用:通过GO富集分析与探究数据库发现NQO1与脂肪酸氧化相关进程及脂肪酸氧化关键酶存在相关性;脂肪酸氧化酶及ATP试剂盒检测结果显示NQO1过表达时胰腺癌细胞中的脂肪酸氧化酶及ATP含量显著增加;采用蛋白免疫印检测,发现NQO1过表达时的胰腺癌细胞中的脂肪酸氧化相关标志物表达水平也被上调;进一步加入脂肪酸氧化酶抑制剂后,通过MTT、平板克隆、细胞划痕和蛋白免疫印迹等实验发现,抑制剂逆转了NQO1过表达对胰腺癌细胞的促进作用;6.NQO1/CPT1A参与胰腺癌的演进:挖掘数据库显示,NQO1与脂肪酸氧化中的限速酶CPT1A呈正相关,并且CPT1A在多种癌组织中高表达;通过免疫荧光共定位实验发现,NQO1/CPT1A共定位于细胞核于细胞质中;进一步Co IP实验验证发现,NQO1与CPT1A具有相互作用关系;泛素化实验中显示,NQO1通过抑制蛋白酶体对CPT1A的泛素化降解,来增加CPT1A的稳定性;在NQO1过表达的胰腺癌细胞系中沉默CPT1A后,平板克隆、Ed U、Transwell、细胞划痕及蛋白免疫印迹实验验证得出,下调CPT1A的表达水平后部分抑制了NQO1过表达对胰腺癌细胞增值能力、迁移及EMT进程的促进作用。结论:NQO1在胰腺癌中高表达,与胰腺癌的恶性演进紧密相关,且NQO1/CPT1A在胰腺癌可以相互作用,并通过激活脂肪酸氧化通路在胰腺癌细胞增殖和转移中发挥了重要作用。