【摘 要】
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【背景】多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）是一种以骨髓浆细胞恶性增生为主的异质性疾病,约占血液肿瘤的10%,发病的中位年龄为75岁,目前已经成为全世界第二大血液恶性肿瘤。目前MM主要的治疗方法有蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、单克隆抗体、造血干细胞移植以及CAR-T细胞输注治疗等。MM仍然不可治愈,大部分患者最终会发展为复发难治。CAR-T治疗作为一种新型的特异性疗法,取得了很好的
【基金项目】
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福建省科技创新联合资金项目（2017Y9005）；
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【背景】多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）是一种以骨髓浆细胞恶性增生为主的异质性疾病,约占血液肿瘤的10%,发病的中位年龄为75岁,目前已经成为全世界第二大血液恶性肿瘤。目前MM主要的治疗方法有蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、单克隆抗体、造血干细胞移植以及CAR-T细胞输注治疗等。MM仍然不可治愈,大部分患者最终会发展为复发难治。CAR-T治疗作为一种新型的特异性疗法,取得了很好的效果。近年来,以BCMA为靶点的CAR-T细胞过继免疫治疗在复发难治MM中取得了很大的进展,总缓解率可达81%。然而,文献报道及我们的前期研究发现,BCMA CAR-T对某些高表达BCMA的细胞杀伤效果很弱甚至没有杀伤作用。故本课题拟通过研究BCMA CAR-T对于不同MM细胞株杀伤作用的差异及其可能原因,阐明MM细胞对BCMA CAR-T杀伤作用不敏感的机制,为提高BCMA CAR-T的治疗效果提供基础研究证据。【方法】1、BCMA CAR-T和不同的高表达BCMA的MM细胞株共培养,通过流式检测凋亡情况,将MM细胞分为两组:杀伤敏感组和杀伤不敏感组;2、效应细胞（BCMA CAR-T细胞）和靶细胞（MM细胞）共培养后,用流式检测效靶细胞结合、效应细胞CD69的表达以及用ELISA检测效应细胞颗粒酶的分泌,比较两组间的差异;3、提取MM细胞膜蛋白,进行银染,采用蛋白质谱分析,研究两组细胞膜表面的差异蛋白;4、CO-IP检测CD305和BCMA之间是否存在作用;5、构建CD305敲减的质粒,通过慢病毒转染的方法将质粒转到不敏感的MM细胞株内,将敲减CD305的MM细胞和BCMA CAR-T细胞共培养,流式检测效靶结合、效应细胞CD69表达以及MM细胞的凋亡;6、构建CD305过表达的质粒,转染到杀伤敏感组MM细胞内,与BCMA CAR-T细胞共培养,检测效应细胞CD69表达、效靶细胞结合以及MM细胞的凋亡。【结果】1、根据MM细胞和BCMA CAR-T细胞分别共培养后的凋亡情况,将MM细胞分为两组,杀伤敏感组为MM.1S、KMS-11和ARD,杀伤不敏感组为AMO-1和LAMA-84;2、杀伤不敏感组在共培养过程中未发现效应细胞和靶细胞的结合,效应细胞无CD69的表达,效应细胞未检出颗粒酶的释放;而杀伤敏感组在共培养过程中发现效应细胞和靶细胞的结合,效应细胞有CD69的表达,效应细胞检出颗粒酶的释放;3、蛋白质谱分析差异蛋白提示,杀伤不敏感组AMO-1和LAMA-84细胞高表达CD305,而杀伤敏感组的3种细胞株未检出CD305的表达;4、杀伤不敏感组MM细胞敲低CD305后,sh CD305-AMO-1和sh CD305-LAMA-84细胞与BCMA CAR-T共培养,效应细胞CD69的表达分别为20.60%和25.00%,但是凋亡率仅分别为6.70%和0.00%。【结论】1、BCMA CAR-T细胞对不同MM细胞株具有不同的杀伤作用。2、BCMA CAR-T杀伤不敏感与MM细胞高表达CD305有关。3、抑制CD305表达可以提高BCMA CAR-T细胞激活能力,是MM治疗的潜在靶点。
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