【摘 要】
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亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée是一种世界性粮食害虫,主要为害玉米、谷子、高粱等粮食作物。利用生防细菌对亚洲玉米螟进行有效的生物防治是当前有害生物综合治理研究的重要方向。本文采用cDNA末端快速扩增（RACE）方法克隆了亚洲玉米螟免疫相关的一氧化氮合酶（NOS2）基因,并进行生物信息学分析;采用两种生防细菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和
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亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée是一种世界性粮食害虫,主要为害玉米、谷子、高粱等粮食作物。利用生防细菌对亚洲玉米螟进行有效的生物防治是当前有害生物综合治理研究的重要方向。本文采用cDNA末端快速扩增（RACE）方法克隆了亚洲玉米螟免疫相关的一氧化氮合酶（NOS2）基因,并进行生物信息学分析;采用两种生防细菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）注射处理了亚洲玉米螟幼虫;同时,为了研究幼虫体内一氧化氮（Nitric oxide,NO）介导钙调磷酸酶A（CalcineurinA,CaNA）调控抗菌肽合成的免疫调控机制,采用幼虫注射NO供体NOC、CaNA抑制剂FK506和NOS抑制剂L-NAME等方法。在果蝇S2细胞中,采用 RNA 干扰（RNA interference,RNAi）、实时荧光定量 PCR（quantitative real time PCR,qPCR）、NO供体NOC处理、CaNA抑制剂FK506处理和NOS抑制剂L-NAME处理等方法,在细胞水平进行了功能验证。实验主要结果如下:（1）利用反转录PCR（RT-PCR）和RACE技术,克隆了亚洲玉米螟幼虫NOS2基因的开放阅读框序列。通过生物信息学分析,确定该基因开放阅读框序列全长为3336 bp,共编码氨基酸1111个。相对分子量为125.77kDa,等电点为6.62。整条肽链都在膜外,无跨膜结构域,无信号肽,为亲水性蛋白,在整条多肽链上有97个磷酸化位点分布。（2）通过qPCR检测4龄亚洲玉米螟不同组织中Of-NOS2的表达水平。结果显示:Of-NOS2基因在头和体壁中表达量较低。相较于头部,血细胞、中肠和脂肪体中Of-NOS2基因的表达量分别为4.27±0.54、3.23±0.87和17.15±1.16倍。该结果表明Of-NOS2基因在脂肪体中高表达。（3）选取亚洲玉米螟4龄幼虫,分别注射铜绿假单胞菌和藤黄微球菌,通过qPCR检测了Of-NOS1、Of-NOS2、Of-CaNA及相关抗菌肽（antimircrobial peptides,AMPs）Attacin、Cecropin A、Defensin、Gloverin、Lebocin-4和Moricin的表达量。结果显示:注射生防细菌后,相关基因在不同时间点均有不同程度的上调表达。当铜绿假单胞菌侵染时,Of-NOS2在12h和48h表达量显著上调;当藤黄微球菌侵染时,Of-NOS2在24h时表达上调量最高（p＜0.001）。（4）在亚洲玉米螟幼虫体内注射NO供体后,幼虫血浆中NO含量显著上调（p＜0.01）。qPCR检测表明:与对照组相比,在12 h和24h时Of-CaNA表达水平显著上调（p＜0.05）。注射CaNA抑制剂FK506的实验中,钙调磷酸酶被阻断活性后,在不同时间点抗菌肽表达量均有不同程度的下调;而注射NOS抑制剂L-NAME抑制了虫体中的NO的产生,NO的减少显著抑制Of-CaNA和抗菌肽的表达（p＜0.05）。以上结果均证明:在亚洲玉米螟抵御细菌侵染的天然免疫反应过程中,NO直接或者间接地参与调控抗菌肽的合成。（5）在果蝇S2细胞中,通过RNAi发现NOS基因的干扰会使得抗菌肽Cecropin A、Defensin、Diptericin和Drosomycin表达水平显著下调（p＜0.05）,而干扰IMD基因和MyD88基因后发现NOS基因与这两个免疫相关的信号通路均有所关联。NO供体NOC诱导S2细胞后,CaNA以及相关AMPs显著上调表达,表明NO对二者均有一定的调控作用;加入CaNA抑制剂FK506将会抑制抗菌肽表达;加入NOS抑制剂L-NAME则会抑制CaNA基因和抗菌肽的表达（p＜0.05）。综上推测NO信号可以介导钙调磷酸酶直接或者间接地通过IMD信号途径调控抗菌肽的表达。
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