系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）一方面是我国最常见的自身免疫性疾病,另一方面继发性肾脏病的病因也常是它。育龄期妇女属于该病的高发人群,发病后人体会产生了大量抗体并同时伴有多种器官脏器受累。在大量医学研究中发现SLE常伴有严重的并发症,有数据表明有60%到80%的患有SLE的病人伴有肾脏受累,在临床研究中多表现为为蛋白尿、血尿,严重的会导致肾衰竭。同时根据观察大量该病患者的肾脏病理检查结果和免疫病理和电镜检查结果,发现患有SLE的患者均有不同程度的肾脏受累,严重的会发展为肾功能衰竭并导致死亡。因此,无论是风湿免疫科还是肾病科的医生都将狼疮性肾炎（Lucus Nephritis,LN）的治疗作为研究重点,并将LN的治疗效果作为SLE预后的重要参考指标。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil gelatinase-associated lipid carrier protein,NGAL,Lcn-2）是一种小分子分泌蛋白,属于lipocalin超家族。在对人类基因研究中发现NGAL基因位于第9号染色体长臂（9q34）,其中含有1695bp的5’端非转录区、178bp的3’端非转录区和3696bp的原初转录区（由7个外显子与6个内含子构成）,总长5869bp,相对分子质量25000。首先,有研究表明中性粒细胞明胶酶载脂蛋白受体（Neutrophil gelatinase-apolipoprotein receptor,NGALR）可能影响细胞的转运功能和NGAL的内化,并已经证实NGALR是一种重要的细胞受体。其次在对肾炎研究中表明:NGALR在没有病变或微小病变的肾组织中几乎没有分布,其主要分布在患有狼疮肾炎的血管系膜细胞上,少部分表达于毛细血管丛上。在大量肾病研究中,发现几乎所有的慢性肾脏病发展到最后都会导致肾脏纤维化,同时伴有肾小球硬化和肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis,RIF）。造成这一结果的原因主要是因为肾病的病理机制,肾病患者多表现为细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）在肾间质中过度积聚以及肾间质成纤维细胞增生。且RIF的病理机制主要是因为肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。所以如果能阻断EMT就可以很大程度上抑制住RIF的进程,而阻断EMT可通过肾小管上皮细胞将其转分化为肌成纤维细胞,再等肌成纤维细胞进入间质后合成ECM。在大量研究中发现,纤维化相关因子的表达水平受NGAL及NGALR的影响,其通过不同的途径或信号通路（如:NGALR将NGAL摄入MC内,影响HMC上调FN、Col IV和CTGF的表达）参与肾脏纤维化相关因子的表达,进而参与肾小球硬化和RIF。在人结直肠癌的研究中发现,NGAL可抑制核因子κB（Nuclearfactorkappa light chain enhancer of activated Bcells,NF-κB）向核内转运,该细胞系中NGAL高表达与NF-κB的表达为负相关。NF-κB又可以通过调控趋化因子的表达和多种炎性因子,进而参与ECM交联与细胞凋亡、纤维细胞增殖分化等过程,因而细胞系中NGAL高表达可一定程度上抑制成纤维细胞的增殖分化、ECM交联及细胞凋亡等过程。目的本研究拟在NGAL/NGALR异常表达与狼疮肾炎发病密切相关的基础上,进一步系统研究分析狼疮肾炎NGAL、NGALR、NF-κB相互调控机制,并参与肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（EMT）进而导致肾间质纤维化,从而介导狼疮肾炎发生发展。通过NGAL及NGALR过表达和抑制实验以及蛋白相互结合检测,深入阐明NGAL、NGALR、NF-κB相互调控关系及机制;通过体外细胞实验观测对肾小管上皮细胞EMT功能影响。方法1.生物信息学收集Nephroseq数据库及GEO数据库质料,采用生物信息学方法,找出与系统性红斑狼疮相关差异性基因,并分析。2.体外实验研究1)细胞模型:肾小管上皮细胞（HK2）由本课题组常规保存并培养。2)NGAL、NGALR表达载体构建:PCR扩增并鉴定目的片段序列,定向克隆入pc DNA3.1表达载体。3)NGAL、NGALR sh RNA设计与构建:通过计算机软件设计靶序列完全互补或含错配碱基的si RNA,同时构建sh RNA载体及相应突变体,生物工程公司合成。4)NGAL、NGALR、NF-κB表达调控检测:分别转染、共转染上述体系及使用NF-κB抑制剂后,实时定量RT-PCR、Western blot检测NGAL、NGALR、NF-κB m RNA及蛋白表达。5)细胞功能学验证:通过转染不同组别细胞,通过CCK-8、EMT及细胞凋亡来综合分析相关功能学改变。结果1.通过Nephroseq数据库检索分析,在正常组织中NGAL及NGALR均呈低表达,在狼疮性肾炎肾脏组织中高表达,且NGAL在狼疮性肾炎肾脏组织中肾小球及肾间质均有高表达;在狼疮性肾炎小鼠中,NGAL的表达在有蛋白尿组小鼠中明显高于无蛋白尿组小鼠。并通过GEO数据库分析NGAL及NGALR对于狼疮性肾炎的预测,其中AUC值均大于0.5。2.成功转染敲低NGALR及过表达质粒NGALR sh RNA片段,通过q RT-PCR及Western blot方法检测分析所转染敲低质粒及过表达质粒,在m RNA水平及蛋白水平均有敲低及过表达,且敲低质粒中NGALR sh RNA1敲低效果最明显,P值均小于0.05,均有统计学意义。3.通过NGAL刺激不同组别的HK2细胞（未转染的HK2细胞、敲低NGALR组HK2细胞及回转过表达NGALR质粒的HK2细胞）,其中NGAL刺激HK2细胞72h后,NGALR及NF-κB的m RNA水平及蛋白水平表达量均高表达;NGAL刺激敲低NGALR HK2细胞后,NGALR及NF-κB的m RNA水平均有升高,且P值均小于0.05,均有统计学差异;NGAL刺激敲低NGALR的回转组HK2细胞后,NGALR及NF-κB的m RNA水平均有升高,且P值均小于0.01,均有统计学差异。4.通过NGAL刺激不同组别的HK2细胞（未转染的HK2细胞、敲低NGALR组HK2细胞）72h后,不同组别的HK2细胞增殖情况无明显差异,且无统计学意义,其中P值大于0.05。5.通过NGAL刺激不同组别的HK2细胞（未转染的HK2细胞、敲低NGALR组HK2细胞及回转过表达NGALR质粒的HK2细胞）,其中NGAL刺激HK2细胞72h后,细胞黏附分子（E-cadherin）及波形蛋白（Vimentin）随时变化均有下降趋势,但无统计学差异,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）随时间变化有升高趋势,且72h时P值小于0.0001,有统计学意义;使用NGAL刺激敲低组HK2细胞后,E-cadherin及Vimentin随时间变化有上升趋势,且有统计学意义,而α-SMA随时间变化无明显差异,且无统计学意义;使用NGAL刺激回转NGALR过表达质粒的NGALR-sh RNA1的HK2细胞,其中E-cadherin随时间的变化明显减低,且有统计学意义,Vimentin随时间的变化稍升高,但无统计学差异,α-SMA随时变化稍升高,且有统计学差异。6.使用NGAL刺激不同组别的HK2细胞48h后,通过Annexin V/7-AAD细胞凋亡试剂盒染色检测,通过使用分析流式细胞仪,得到凋亡结果:早期凋亡及晚期凋亡均有抑制,且有统计学差异。结论1.通过Nephroseq数据库检索分析,NGAL及NGALR在狼疮性肾炎呈高表达,且通过GEO数据库分析,对于LN有一定预测作用;并且通过Nephroseq数据库中狼疮性肾炎小鼠中分析得到,NGAL可能与狼疮性肾炎活动相关。2.使用NGAL刺激正常HK2细胞及敲低组和回转过表达NGALR后,NGALR及NF-κB均有升高,而PBS组无明显变化,推测外源性增加NGAL后,可与膜蛋白受体NGALR结合,激活NF-κB通路。3.通过CCK-8实验分析,可以推测出NGAL对于HK2细胞增殖无影响。4.使用NGAL刺激不同组别的HK2细胞后,可以推测出NGAL与NGALR结合,同时可以促进EMT的发展。5.使用NGAL刺激不同组别的HK2细胞后,可以推测出NGAL与NGALR结合,从而抑制细胞凋亡。