玉米（Zea mays L.）是重要粮食、饲料和工业原料作物之一,其产量和品质受缺磷胁迫的制约。磷（Phosphorus,Pi）是作物吸收利用的三大元素之一,在生物体能量代谢、结构支撑中起着重要作用。由于土壤中的磷有效利用率极低,现已成为限制植物生长发育的主要因子之一。研究发现,植物对生长素和磷（Pi）饥饿的反应紧密相连。低磷条件下生长素受体TIR1基因的表达显著上调,导致AUX/IAA蛋白降解,从而释放ARF7/19,促进拟南芥侧根的生长发育。然而,生长素与磷饥饿（-Pi）反应相关的潜在机制尚不清楚。生长素响应因子（auxin response factor,ARF）是一类受生长素调节的转录因子,在生长素信号传导途径和根系建成中起着重要的作用。研究ZmARF生物学功能及其对缺磷胁迫的响应机制,有助于为生长素与磷饥饿（-Pi）反应之间的联系提供新的证据,并为玉米有效利用Pi提供新的策略。课题组前期通过对缺磷胁迫下ZmARF家族基因初步定量,筛选到若干个关键候选基因ZmARFs响应玉米根系的缺磷胁迫。本研究将重要候选基因之一ZmARF4作为研究对象,克隆了玉米低磷极端自交系中ZmARF4基因全长序列进行比对,探究了其启动子活性差异,同时分析缺磷胁迫下ZmARF4基因的表达模式,并结合拟南芥和玉米的遗传转化实验初步探讨了ZmARF4的生物学功能及其对缺磷胁迫的响应,再利用酵母双杂交文库筛选ZmARF4的互作蛋白,为探究ZmARF4可能参与的生物学调控通路提供基础。具体研究结果如下:1、玉米耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中ZmARF4的启动子活性存在显著差异,且均响应缺磷胁迫。克隆自交系178和自交系9782中ZmARF4基因全长序列比对发现,序列差异主要在启动子区域。p ZmARF4178/9782分别与GUS报告基因融合,利用烟草叶片瞬时表达系统和GUS组织化学染色,结果表明耐低磷自交系178的ZmARF4启动子活性显著高于低磷敏感材料9782。组织特异性表达检测显示,pZmARF4178-GUS在拟南芥叶脉、叶柄、初生根（成熟区的中柱）中表达。western blot检测发现,与未处理（0 h）相比,随着缺磷胁迫处理时间增加,转基因拟南芥的GUS蛋白积累量逐渐增多。2、ZmARF4在玉米耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782根系中响应缺磷胁迫,表达模式差异显著。正常供磷条件下,ZmARF4在自交系178和9782根系中的表达量均显著高于叶片,且在耐低磷自交系178根系与叶片中的相对表达量均显著高于低磷敏感自交系9782,在根系中的表达丰度差异高达4倍。缺磷胁迫处理后,叶片中ZmARF4的相对表达量维持稳态水平。在耐低磷自交系178根系中,ZmARF4总体呈先上升后下降的表达趋势,而在低磷敏感自交系9782根系中显著上调表达。亚细胞定位结果显示,ZmARF4蛋白在玉米中主要定位在细胞核,细胞质有少量表达。3、ZmARF4具有促进植物根系生长发育的生物学功能,促进了玉米株高和产量的提高。拟南芥arf7 arf19双突突变体丧失了侧根的发生,ZmARF4过表达能部分恢复突变体侧根的发生和伸长。在玉米KN5585中过表达ZmARF4增强了玉米根系的生长发育,株高和穗重都显著高于野生型。4、ZmARF4在低磷条件下促进磷的吸收,并增强了对盐和渗透胁迫的耐受性。在拟南芥Col-0中过表达ZmARF4显著抑制主根的伸长。而在低磷胁迫条件下,拟南芥正常生长受到抑制,表现出侧根增多,根长变短的表型,但过表达ZmARF4的拟南芥株系叶片更绿,根毛更密集,其根直径显著大于Col-0。正常供磷条件下,拟南芥Col-0中的磷含量与ZmARF4过表达株系差异不显著。低磷处理后,过表达株系中磷含量的下调幅度显著低于野生型,磷转运基因AtPht1:4上调幅度极显著高于野生型。同时还发现,盐、渗透胁迫下过表达株系的总根长、根表面积和根尖数均显著高于野生型。5、ZmARF4具有转录激活活性,酵母文库筛选检测到与ZmChc5、ZmILL4互作。酵母双杂交文库筛选与ZmARF4互作结果表明,与ZmARF4互作的部分候选基因功能注释主要与植物的生长发育、防御反应相关。酵母回转验证ZmARF4能与几丁质酶ZmChc5以及IAA氨基酸水解酶ZmILL4互作。克隆ZmChc5和ZmILL4的全长CDS序列,分别构建Ca MV35S::ZmChc5:RFP和Ca MV35S::ZmILL4:RFP的融合表达载体。亚细胞定位显示,ZmChc5与ZmILL4在玉米中主要定位于细胞质。