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大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)是我国重要的海水经济养殖鱼种。随着大黄鱼养殖产业的快速发展，海水养殖过程中由细菌、病毒和寄生虫所引起的病害问题日益严重，导致了巨大的经济损失。
半胱氨酸蛋白酶(cysteineproteases)存在于所有生物中，在各种生理和病理过程中发挥着非常重要的作用。研究表明，半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂（cystatin）对半胱氨酸蛋白酶活性的调节对生物体正常生理功能的发挥是非常重要的。cystatin是一类天然的、能与组织蛋白酶紧密结合的可逆抑制剂，广泛分布于动物组织和体液中。cystatin包含3个保守的结构域，即N-末端的Gly、第一个β-发夹结构的Gln-X-Val-X-Gly和第二个β-发夹结构的Pro-Trp，它们对cystatin的抑制活性至关重要。在前期研究中通过对大黄鱼脾脏转录组分析发现了一条编码哺乳类cystatinC同源物的表达序列标签（expressedsequencetag，EST），命名为大黄鱼cystatinC(lyccystatinC)。本文进一步对lyccystatinC进行了序列分析，发现lyccystatinC的第一个和第二个β-发夹结构与经典的cystatin家族成员不同，分别为Gln79-Val-Thr-Asn-Val83和Pro125-Arg126。Blastp分析发现，在鱼类中存在一类与lyccystatinC的第一个和第二个β-发夹结构类似的cystatin。进化分析表明，这类cystatin家族成员形成一个独立的一簇，提示可能是一类具有新结构域的cystatin。
本文系统地研究了lyccystatinC3个保守区域中的各保守氨基酸在cystatin抑制活性中的作用。通过定点突变和删除突变的方法分别构建了20个lyccystatinC突变体重组表达质粒，并在毕赤酵母中进行了重组表达，得到了纯化的重组蛋白，测定了它们对papain、cathepsinL和S（组织蛋白酶L和S）的抑制常数。实验结果显示:(1)将lyccystatinC成熟肽N-末端Gly35（包括Gly35）前面的17个氨基酸删除后，其对papain抑制常数增加177倍，对大黄鱼cathepsinL和S则完全没有抑制活性。分别将Leu33残基和Gly35残基分别突变为Arg，实验结果表明Leu33突变为Arg之后，突变体蛋白rlyccystatinCL33R（表示将lyccystatinC第33位氨基酸由Leu突变为Arg，rlyccystatinC为重组表达lyccystatinC，下同）对papain和cathepsinS的抑制活性没有显著性影响，但对cathepsinL的抑制活性降低了约9倍;将Gly35突变为Arg之后，突变体蛋白rlyccystatinCG35R对三种组织蛋白酶均没有抑制活性。(2)通过删除整个Gln79-Val-Thr-Asn-Val83区域后，发现删除Gln79-Val-Thr-Asn-Val83后的突变体蛋白rlyccystatinCdel-QVTNV（del-QVTNV表示将QVTNV删除，下同）完全失去抑制活性，不能抑制任何一种组织蛋白酶的活性;突变体rlyccystatinCQ79I对papain的抑制常数增加207倍，但对cathepsinL和S的抑制常数只增加了14倍和3倍;突变体rlyccystatinCQ79P对papain、cathepsinL和S都失去抑制活性;突变体rlyccystatinCV80G对papain的抑制常数增加654倍，而对cathepsinL和S的抑制常数只增加了15.8倍和36倍，突变体rlyccystatinCV80E对papain的抑制常数增加202倍，而对cathepsinL和S的抑制常数只增加了3.8倍和3.4倍，突变体rlyccystatinCV80K对papain的抑制常数增加582倍，而对cathepsinL和S的抑制常数只增加了4.57倍和3.56倍;将Thr81突变为Val后对其活性没有显著性改变，但若将Thr81突变为Glu后其对papain的抑制常数增加191倍，而对cathepsinL和S的抑制常数只增加了13.66倍和38.71倍;将Asn82突变为Tyr，Val83突变为Gly和Phe后对其活性没有显著性改变;而删除Gln79、Thr81和Val83后其对papain、大黄鱼cathepsinL和S完全没有抑制活性。(3)将第三个保守区域的Arg126替换为Trp的突变体蛋白rlyccystatinCR126W对papain、cathepsinL和S的抑制活性与野生的lyccystatinC相当，而替换为Gly的突变体蛋白rlyccystatinCR126G对papain的抑制活性与野生的rlyccystatinC相当，但对cathepsinL和S的抑制常数都提高10倍左右。这些结果表明lyccystatinC的N-末端及该末端的Gly35、第一个β-发夹结构Gln79-Val-Thr-Asn-Val83是lyccystatinC抑制活性必不可少的;第一个β-发夹结构中，Gln79、Val80和Thr81侧链基团性质的改变会显著性影响lyccystatinC抑制活性，而其他两个氨基酸的改变不会显著性影响lyccystatinC的抑制活性，与其他cystatin不同，Val83突变为Gly和Phe未对lyccystatinC抑制活性造成大的影响，说明Val83的侧链基团并不会影响第一个β-发夹结构和第二个β-发夹结构的相互作用;第三个保守区域Arg126突变为Gly不会对lyccystatinC对papain的抑制活性造成大的影响，但对cathepsinL和S的影响较大，Arg126突变为Trp对其活性没有显著性影响说明lyccystatinC的第二个β-发夹结构与cystatin家族其他成员不同并不显著影响其活性。上述结果表明本lyccystatinC与papain家族半胱氨酸组织蛋白酶的相互作用与其他cystatin存在不同。本文研究结果有利于进一步了解cystatin抑制papain家族半胱氨酸组织蛋白酶活性的分子机制。
为了研究大黄鱼cystatinC在抗原提呈中的作用，本文克隆表达了大黄鱼恒定链(Invariantchain，Ii)，并制备了多克隆抗体，并在大黄鱼脾脏和肾脏中检测到了Ii链全长蛋白。体外实验结果表明，与哺乳动物不同，大黄鱼cathepsinL不能加工处理Ii链，cathepsinB和S能加工处理Ii链。lyccystatinC能抑制cathepsinB和S对Ii链的加工处理过程。这些结果有助于了解大黄鱼抗原提呈的机制及cystatin和cathepsin在该过程中的作用。