论文部分内容阅读
目的:霍山石斛为兰科石斛属植物。基于Illumina MiSeqTM高通量测序技术,(1)比较五种不同生长模式的霍山石斛内生真菌的多样性和差异性;(2)比较设施栽培模式下,不同生长年限的霍山石斛茎段内生真菌的多样性和差异性;(3)通过分离、纯化霍山石斛内生真菌,筛选出霍山石斛中具有抑菌活性的内生真菌,并进行分子水平鉴定。探明不同生长模式和不同生长年限的霍山石斛内生真菌的多样性和差异,同时考察内生真菌潜在的提升植株的抗病害能力,为生态栽培提供发酵菌肥研制提供基础数据。方法:(1)采用E.Z.N.A~TMM Mag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒提取DNA,通用引物ITS1和ITS2对基因组DNA进行两轮PCR扩增,MiSeq测序平台进行测序,得到的原始图像数据经过CASAVA碱基识别转化为原始测序序列,再进行数据预处理去除引物接头,去除嵌合体及非特异性扩增序列,根据序列之间的相似性(97%)将序列分成不同的操作分类单元即OTU,最后进行Alpha、Beta多样性分析、物种分类分析、多维度分析、菌群差异分析等统计分析。(2)选用组织切片和组织研磨两种方法对霍山石斛的根、茎、叶组织的内生真菌进行培养,采用平板对峙法和牛津杯法对菌块及菌块发酵液考察抑菌效果,并对有抑菌效果的菌株进行分子鉴定。结果:(1)霍山石斛含有丰富的内生真菌;Alpha多样性指数分析显示林下栽培模式下与野生模式下霍山石斛之间有显著性差异(P=0.021);内生真菌群落组成分析表明:Alternaria在五种生长模式下的霍山石斛内生菌中存在极显著差异(P<0.01),LEfSe组间内生菌菌群显著性差异分析表明:野生霍山石斛与林下石栽、树栽、仿野生栽培、设施栽培四组存在明显差异的有8个真菌属,即Helotiales sp.、Stenella、Helotiales、Setophoma、Articulospora、Didymosphaeriaceae sp.、Teichosporaceae sp.和Devriesia;仿野生霍山石斛和其他四组存在明显差异的有Diaporthe和Strelitziana 2个属,可以有效区别与其它生长方式的霍山石斛。(2)设施栽培模式下,不同生长年限的霍山石斛ⅠY1、ⅡY2、ⅢY3三组之间,ⅢY1、ⅢY2、ⅢY3三组之间的α-多样性分析均无显著差异。ⅠY1、ⅡY2、ⅢY1、ⅢY2、ⅢY3五组样品优势真菌菌群存在差异,Fusarium在ⅡY2、ⅢY3、ⅢY1、ⅢY2四组的丰度明显高于IY1;Zymoseptoria IY1、ⅡY2、ⅢY1、ⅢY2四组的丰度明显高于ⅢY3;与其他四组相比,Cladosporium只在IY1中占明显优势;与其他四组相比,Cyphellophor、Trechispora在ⅢY3中占明显优势;仅在ⅢY1和ⅢY2中占优势的为Zasmidium。Cyphellophor在ⅢY3中占明显优势,Zymoseptoria在IY1、ⅡY2、ⅢY1、ⅢY2四组中的丰度明显高于ⅢY3。(3)通过分离、纯化霍山石斛内生真菌,共分离内生真菌64株,其中组织切片法分到26株,组织研磨法分到38株;其中组织研磨法从根、茎、叶三个部位分别分离到真菌16株、11株、11株。对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏杆菌均有抑制作用的SH01属于烟曲霉菌Aspergillus fumigatus;对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用的GL13、GR4为橘青霉Penicillium citrinum、SH02为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、GS01为Penicillium rubens。结论:(1)霍山石斛内生真菌丰度和多样性受栽培模式影响,林下栽培与野生的霍山石斛内生真菌多样性有显著性差异,林下石栽、树栽、仿野生栽培、设施栽培四种栽培品种与野生品种之间的菌群多样性存在显著差异,且存在差异菌。(2)霍山石斛内生真菌丰富度和多样性受生长年限的影响较小,不同生长年限有不同的优势菌,同一生长年限(三年)分出的ⅢY1、ⅢY2、ⅢY3也有各自的优势菌群。(3)组织研磨法分离霍山石斛内生真菌比组织切片法更有优势;不同组织部位内生真菌丰度和多样性存在差异,根部分离内生真菌的数量大于茎部和叶部。