十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）和隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）是重要的食源性和水源性病原,感染包括人类在内的多种哺乳动物,具有重要的公共卫生意义。尽管对于隐孢子虫的虫种/基因型分布研究在西班牙已开展较多,但多数研究集中在畜牧业发达地区,研究群体主要是牧场周围人群和牧场动物,而对十二指肠贾第虫的研究较少,所以导致我们对这两种病原在西班牙城市人群和儿童中的多样性和流行病学特征并不是很清楚。因此,本研究围绕这两个病原在西班牙多个城市医院病人进行多样性和感染率的研究,以了解相应疾病在当地的流行特征以及在全基因组水平上的遗传特征。从2010年至2018年,我们从西班牙多个城市和地区医院的住院、门诊和急症病人中,收集镜检结果为十二指肠贾第虫或隐孢子虫阳性的粪便样品。首先,采用基于十二指肠贾第虫的磷酸丙糖异构酶基因（triosep-hosphateisomerase,tpi）、β-giardin基因（bg）和谷氨酸脱氢酶基因（glutamate dehydrogenase,gdh）的巢式PCR结合测序的方法,对十二指肠贾第虫进行集聚体鉴定。之后,采用基于隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR结合限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）的方法,和基于60 kDa糖蛋白基因（60 kDa glycoprotein,gp60）的巢式PCR结合测序的方法,分别对隐孢子虫进行虫种和亚型的鉴定。最后,对集聚体/虫种与病人的年龄、临床症状以及感染季节的关系进行分析。在125份十二指肠贾第虫镜检阳性样本中,97份为PCR 阳性,共检测出两种集聚体。其中,集聚体为A的十二指肠贾第虫29份,集聚体为B的十二指肠贾第虫66份,另外有2份样本混合感染有这两个集聚体。多位点分型结果显示,共包含4个Multilocus Genotyping A（MLG-A）基因型和19个MLG-B基因型,其中MLG-B1基因型为优势亚型,占全部集聚体B多位点基因型总数的51.9%。样本大部分来自儿童（54/97）,并且有38个样本来自年龄小于5岁的儿童。儿童主要感染集聚体B的十二指肠贾第虫（44/53,83%）,而成年人中集聚体 A（20/42,47.6%）和集聚体 B（22/42,52.4%）的十二指肠贾第虫的感染比例大致相同,表明儿童和成年人在感染十二指肠贾第虫方面存在显著差异（P=0.001）。此外,男性患者的十二指肠贾第虫感染率显著高于女性患者（P=0.049）,而无症状的感染更多出现在感染集聚体A的患者中（P=0.029）。以上结果表明,人-人的传播方式在样本采集地区的十二指肠贾第虫传播过程中发挥了重要作用,其中儿童和成年人的十二指肠贾第虫感染来源不同,并且不同集聚体的十二指肠贾第虫所引发的临床症状不同。在104份隐孢子虫镜检阳性样本中,99份样本为PCR阳性,共检测出两种类型的隐孢子虫。其中,人隐孢子虫（C.hominis）92份,微小隐孢子虫（C.parvum）6份,另外有1个样本混合感染有这两个虫种。并分别从这两个虫种中发现了 3个和4个基因亚型,其中优势基因亚型为IbA10G2（从90个样品中检测到）。样本绝大部分来自儿童（97/99）,并且有70个样本来自年龄小于5岁的儿童,同时7～9月为疾病的高发季节。由于疾病高发季节与当地暑假时间相一致,因此以上结果表明,人-水-人的传播可能是样本采集地区隐孢子虫病传播的主要途径,并且游泳在当地疾病传播中可能发挥了重要作用。尽管本研究发现的隐孢子虫优势亚型和传播方式与大多发达国家的情况类似,但与发展中国家的优势亚型和传播方式（人-人的直接传播）存在明显不同。为深入了解感染西班牙病人的隐孢子虫的分子特征,我们进一步对在该地区采集的部分隐孢子虫阳性样本进行了全基因组测序工作,并与实验室前期积累的分离株序列和GenB ank中已有的基因组信息进行比较。首先对课题组前期报导的用于全基因组测序的DNA分离、富集和质控方法进行了改进,发现在进行这些处理前,增加对粪样中隐孢子虫的定量PCR检测,并根据Ct值确定是否对样本进行后续操作,是提高测序成功率、减少工作量,降低后期测序费用的有效方法。结果表明,Ct值越低,测序成功率越高。当Ct≤25时,测序成功率为86.5%;25＜Ct≤30时,测序成功率为65.5%;Ct＞30时,测序成功率为10.5%。基于此标准,成功对采自西班牙的部分阳性样品进行了全基因组测序。通过系统进化树的构建发现,西班牙样本之间在进化上的关系较为接近。通过对单核苷酸多态性（SNPs）的分析发现,大部分西班牙样本间的差异较少（SNPs数目位于16-26之间）,来自瑞典和希腊样本的SNPs数目为65和24。在同美国分离株进行SNPs的分析比较时发现,西班牙样本的SNPs数目位于59-116之间,而美国样本的SNPs数量为1362。通过对小基因插入和缺失情况的研究发现,西班牙样本和美国样本之间存在较大差异。以上结果表明,西班牙隐孢子虫样本与欧洲其他国家的样本在遗传上较为接近,但与美国部分地区隐孢子虫样本的遗传差异较大。综上,本课题发现了集聚体B的十二指肠贾第虫和人隐孢子虫在西班牙多个城市的医院病人中分布广泛,并且儿童是这两种寄生虫的主要感染人群。建立了全基因组测序前样本的初筛方法,并发现西班牙样本与欧洲其他国家的样本在遗传上较为接近,但与美国部分地区样本的差异较大。以上结果有助于了解十二指肠贾第虫和隐孢子虫在西班牙人群中传播特征,并为制定适用于不同地区的疾病防控策略提供理论依据。