针对寒地水稻冷害频发的特点及转录因子在植物对低温的反应中起着重要的调控作用，本研究：（1）从三种抗寒植物中分离了bHLH转录因子家族中与冷胁迫相关的三个ICE1-like基因，并进行了序列分析和功能预测。（2）分析了ICE1-like基因的组织及相应胁迫表达模式，对基因进行了原核表达，并利用酵母单杂交对其转录激活域进行了验证。（3）构建植物表达载体对水稻进行遗传转化，利用超表达ICE1-like基因的转基因水稻株系对所克隆基因进行了功能验证，对其在转基因水稻中的抗冷效果进行评价及冷反应通路的调控模式进行分析，以期获得在水稻冷害改良方面具有应用潜力的候选基因，为培育抗冷害水稻品种奠定理论基础。主要研究结果如下：（1）利用SON-PCR和RT-PCR技术从生菜中分离到一个ICE1-like基因，命名为LsICE1（获得基因登录号为HQ848932），其cDNA片段长1622bp，含有一个1497bp完整的开放阅读框，编码498个氨基酸；利用SON-PCR和RT-PCR技术从大白菜中分离到一个ICE1-like基因，命名为BcICE1（获得基因登录号为HQ902162），其cDNA片段长1591bp，含有一个1494bp完整的开放阅读框，编码498个氨基酸；利用电子克隆和RT-PCR技术从萝卜中分离到一个ICE1-like基因，命名为RsICE1（获得基因登录号为HQ891287），其cDNA片段长1375bp，含有一个1266bp完整的开放阅读框，编码421个氨基酸。LsICE1、BcICE1、RsICE1蛋白与拟南芥ICE1蛋白一级结构和二级结构极其相似，与其它植物ICE1-like家族蛋白的C末端区域一致性很高，并且具有高度保守的bHLH结构域、SUMO结合位点和核定位信号区。其中，LsICE1蛋白与葡萄的ICE1-like蛋白处于同一进化分枝；BcICE1蛋白与山嵛菜及盐芥菜的ICE1-like蛋白处于同一进化分枝；RsICE1蛋白与山嵛菜等十字花科的ICE1-like蛋白处于同一进化分枝。（2）组织表达分析表明，LsICE1、BcICE1、RsICE1基因在生菜、大白菜和萝卜的根、茎、叶中均有表达。其中，LsICE1基因在生菜幼苗叶的表达量最强，BcICE1基因在大白菜幼苗茎的表达量最强，而RsICE1基因在萝卜幼苗根的表达量最强。诱导表达分析表明，在低温（4℃）和高盐（200mM NaCl）胁迫处理的幼苗中，LsICE1、BcICE1、RsICE1基因表达量呈现是先上调后下降趋势，说明低温和高盐处理都能影响基因的表达。100μMABA胁迫处理能上调LsICE1、BcICE1基因表达量，但对RsICE1基因表达量影响较小。此外，7%PEG6000干旱脱水处理对LsICE1、BcICE1、RsICE1基因的表达量影响不大，说明三个基因对脱水胁迫不敏感。（3）构建了LsICE1、 BcICE1、 RsICE1基因原核表达载体pET32a-LsICE1、pET32a-BcICE1、pET32a-RsICE1，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选重组菌株，经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测到大小与预测一致的特异蛋白产物。构建携带LsICE1、BcICE1、RsICE1基因转录激活载体进行酵母单杂交，酵母转化菌株可以在SD/-Trp平板上生长，并能被X-Gal染成蓝色，表明LsICE1、BcICE1、RsICE1基因可以激活酵母下游的报告基因表达，具有转录激活功能。（4）构建了LsICE1、BcICE1、RsICE1基因超表达载体，通过农杆菌介导法，将LsICE1、BcICE1、RsICE1基因导入单子叶模式植物水稻中，使LsICE1、BcICE1、RsICE1基因在水稻中超量表达。通过PCR、PCR-Southern和RT-PCR检测，共获得47株外源基因超表达的转基因水稻植株。其中，14株转LsICE1基因水稻植株，16株转BcICE1基因水稻植株，17株转RsICE1基因水稻植株。T₀代转基因水稻的生长速度比非转基因水稻慢，生育期延迟，转基因植株的株高、穗长、穗粒数、千粒重和结实率与非转基因植株有较大差异。（5） χ2测验结果表明，33个T₀代转基因植株自交种子（T₁代）均发生了潮霉素抗性分离。其中，13个植株种子的潮霉素抗感分离比均不符合3:1，目的基因可能是以非单拷贝单位点形式整合，20个植株种子潮霉素抗感分离比符合3:1，目的基因可能是以单拷贝单位点形式整合。（6）低温恢复生长法测定转基因株系在冷胁迫下的存活率，有11个株系较未转基因对照表现出明显的抗寒性（P<0.01）。11个转基因水稻株系存活率大小依次为：T₁L11>T₁L7>T₁L26>T₁L2>T₁L37>T₁L21>T₁L32>T₁L27> T₁L15>T₁L30>T₁L19。其中，转LsICE1基因抗寒水稻株系存活率>转BcICE1基因抗寒水稻株系存活率>转RsICE1基因抗寒水稻株系存活率。（7）在低温胁迫过程中，转基因株系的相对电导率和丙二醛含量积累速率明显低于非转基因对照。低温胁迫72h后，11个转基因抗寒水稻株系最终相对电导率大小依次为：T₁L19>T₁L27>T₁L30>T₁L32>T₁L15>T₁L2>T₁L21>T₁L26>T₁L7>T₁L11>T₁L37，均显著低于未转基因对照（P<0.01）。11个转基因抗寒水稻株系最终相对电导率增幅大小依次为：T₁L19>T₁L30>T₁L27>T₁L15>T₁L32>T₁L37>T₁L21>T₁L2>T₁L7>T₁L26>T₁L11，均低于未转基因对照增幅。其中，转RsICE1基因抗寒水稻株系相对电导率增幅>转BcICE1基因抗寒水稻株系相对电导率增幅>转LsICE1基因抗寒水稻株系相对电导率增幅。11个转基因抗寒水稻株系最终丙二醛含量大小依次为：T₁L19>T₁L30>T₁L27>T₁L15>T₁L32>T₁L21>T₁L37>T₁L2>T₁L7>T₁L11>T₁L26，均显著低于未转基因对照（P<0.01）。11个转基因抗寒水稻株系最终丙二醛增幅大小依次为：T₁L19>T₁L30>T₁L27>T₁L15>T₁L32>T₁L37>T₁L21>T₁L2>T₁L26>T₁L7>T₁L11，均低于未转基因对照增幅。其中，转RsICE1基因抗寒水稻株系丙二醛增幅>转BcICE1基因抗寒水稻株系丙二醛增幅>转LsICE1基因抗寒水稻株系丙二醛增幅。（8）低温胁迫下，LsICE1、BcICE1、RsICE1基因能促进转基因水稻脯氨酸大量合成。转基因抗寒水稻株系最终游离脯氨酸含量大小依次为：T₁L27>T₁L21>T₁L15>T₁L7>T₁L2>T₁L11>T₁L26>T₁L32>T₁L37>T₁L19>T₁L30，显著高于未转基因对照（P<0.01）。转基因抗寒水稻株系最终游离脯氨酸增幅大小依次为：T₁L27>T₁L2>T₁L15>T₁L21>T₁L7>T₁L11>T₁L26>T₁L30>T₁L32>T₁L37>T₁L19，高于未转基因对照增幅。其中，转RsICE1基因抗寒水稻株系脯氨酸增幅>转LsICE1基因抗寒水稻株系脯氨酸增幅>转BcICE1基因抗寒水稻株系脯氨酸增幅。（9） Southern blot分析结果显示，转LsICE1基因抗寒水稻株系（T₁L2、T₁L7和T₁L11）、转BcICE1基因抗寒水稻株系（T₁L15、T₁L19、T₁L21和T₁L26）和转RsICE1基因抗寒水稻株系（T₁L27、T₁L30、T₁L32和T₁L37）中的目的基因均是以单拷贝单位点形式整合，与χ2测验结果完全一致。Northern blot进一步分析结果显示，目的基因LsICE1、BcICE1、RsICE1基因在11个T₁代转基因抗寒水稻株系中能够正常表达。（10）利用实时定量PCR对转基因水稻冷胁迫转录因子OsDREB1F、OsDREB1B、OsDREB1A基因进行表达分析表明，在冷胁迫下，LsICE1、BcICE1基因对转基因水稻抗寒性的影响是依赖CBF/DREB1冷反应通路的，而RsICE1基因对转基因水稻抗寒性的影响是不依赖CBF/DREB1冷反应通路的。其中，LsICE1基因能够显著上调OsDREB1A基因的转录水平（P<0.05），而BcICE1基因能够显著上调OsDREB1F基因的转录水平（P<0.05）。