【摘 要】
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香菇（Lentinula edodes）是世界上种植最广泛的食用蘑菇之一,其香气独特、味道鲜美、肉质肥厚并且具有抗肿瘤等多种药用价值,已经成为我国规模化生产的主要食用菌之一[1-2]。目前对于香菇重要性状的遗传规律研究及新品种选育工作的深入研究一直是产业发展的迫切需求。并且近年来,随着裂褶菌（Schizophyllum commune）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、草菇（Vol
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香菇（Lentinula edodes）是世界上种植最广泛的食用蘑菇之一,其香气独特、味道鲜美、肉质肥厚并且具有抗肿瘤等多种药用价值,已经成为我国规模化生产的主要食用菌之一[1-2]。目前对于香菇重要性状的遗传规律研究及新品种选育工作的深入研究一直是产业发展的迫切需求。并且近年来,随着裂褶菌（Schizophyllum commune）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、草菇（Volvariella volvacea）、香菇（L.edodes）[3-7]等基因组测序工作的相继完成,大量功能未知的食用菌DNA序列需要进一步的解析[8]。而采用反向遗传的分子生物学方法能够有效地验证基因的功能,其中RNAi技术便是其中的有效工具之一,该技术能够特异性降低甚至关闭特定基因的表达,从而达被广泛用于探索基因功能的研究中。但目前在香菇（L.edodes）中对RNAi技术及应用的研究尚处起步阶段,因此本课题旨在建立适用于香菇基因功能研究的RNAi体系。主要开展以下工作:（1）选择香菇内源URA3（内源乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因）作为目的基因兼筛选标记,用于香菇RNAi系统的建立。提取香菇单核菌株的基因组DNA,分析香菇URA3基因序列,设计相关引物,同时完成香菇35S及GPD启动子的引物设计工作,进而完成对目的片段的扩增和纯化;（2）利用香菇的内源基因URA3作为反向筛选标记,选取基因保守区域451-884bp的反向互补片段为干扰片段,选择具有潮霉素抗性基因的p CAMBIA1390和GPi E为载体原始骨架,分别构建了两种结构的RNAi载体即:采用香菇Lgpd启动子与35S启动子将p CAMBIA1390改造为发卡结构载体Hp V;将GPi E改为双启动子载体Dp V-2。（3）本研究选择以香菇单核菌株220为试验材料,采用小米粒为介质的农杆菌遗传转化法侵染香菇菌丝,对于获得的转化子首先用潮霉素（Hyg）+尿嘧啶抗性进行初筛,初筛后转化子在用尿嘧啶+cef的PDA平板上经5次传代后进行Hyg基因的PCR验证,经送样测序比对后分别获得了稳定生长的香菇双向启动子的RNAi转化子,以及香菇发卡结构启动子的RNAi转化子。再将所获得的转化子在5-FOA+尿嘧啶的培养基上进行表型观察,发现转化子较野生型菌株可以更好的在其平板上进行生长,随机对获得的转化子独立取样进行实时荧光定量PCR分析URA3基因表达量的降低情况,并获得了3个表达量较为显著的双向启动子的RNAi转化子和12个表达量较为显著的发卡结构启动子的RNAi转化子。其中发夹结构的Hp V转化子具有较强沉默干扰效率,其中获得较强干扰效率的转化子比例可达60%,URA3表达量降低最多可达原野生型菌株的0.1。因此认为,所建立的RNAi体系可以成功实现对内源基因URA3表达的干扰。（4）用已建立的RNA干扰体系,再次选取另外两个不同背景的单核菌株Gsm207和Bsm83作为受体材料,分别用已经构建好的两个RNAi质粒进行遗传转化试验,最终通过比较3个不同单核菌株及两个不同RNAi载体的转化子,发现Gsm207和Bsm83的香菇单核菌株同样也可以被干扰成功,并且两种不同载体的干扰效率相差不大,但通过菌株Bsm83作为受体材料可以获得更高效率的转化子,同时所获得的转化子也具有较高的沉默效果,一定程度上均优于菌株Gsm207作为受体材料得到的沉默转化子。同时,本研究也比较了同一转化子不同菌丝部位的转化情况以及URA3基因的表达降低情况,结果表明,香菇菌丝转化子的不同部位的菌丝的转化结果不同,并且同一RNAi转化子的不同部位存在URA3基因表达量降低水平不同。上述结果表明,本课题完成了农杆菌介导的内源URA3基因的沉默体系在香菇中的建立,为今后研究香菇中其他基因的基因功能以及在香菇中进行多基因沉默的研究奠定基础。
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