猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCo V）是目前δ冠状病毒仅为猪源的肠道病原,临床主要表现为急性水样腹泻、呕吐、脱水及死亡等特征。目前,该病呈全球性分布,在我国多个省份的猪场中均检测到,已经成为危害新生仔猪健康的新型肠道病原。本研究开展了PDCo V CHN-SC2015株的N基因克隆与生物信息分析、构建了PDCo V N基因荧光定量RT-PCR,表达重组N蛋白并开展了多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立,为后续开展PDCo V的诊断与防控研究提供材料。1.PDCo V的N基因克隆及生物信息学分析根据NCBI登录的PDCo V N基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR扩增PDCo V N基因,构建N基因克隆质粒,并进行基因序列测定及变异分析。结构显示,扩增所得的PDCo V N基因全长1026bp,命名为CHN-SC2015株N基因与CH/Sichuan/S27/2012的N基因相似性达98.93%。构建遗传进化树,结构显示CHN-SC2015毒株N基因与中国大陆分离的PDCo V毒株的N基因亲缘关系较近,并且与其中CHN/Jingsu/2014株关系最为接近;但与美国、越南、日本及泰国分离的PDCo V毒株亲缘关系较远。通过对CHN-SC2015毒株N蛋白氨基酸序列进行网上软件预测,显示该蛋白为含有丰富无规则卷曲的稳定的亲水蛋白,并且不存在跨膜区和信号肽。2.猪δ冠状病毒SYBR GREENⅠ荧光定量PCR方法的建立本研究根据Gen Bank数据库中的PDCo V N基因保守区域设计一对特异性引物,制备阳性标准品,建立猪δ冠状病毒SYBR GREENⅠ荧光定量PCR方法。结果显示,当拷贝数在4.66×10~4-4.66×10~8copies/μL时,建立的标准曲线最理想。通过标准曲线得到的方程为y=-3.357x+37.989;最低可检测到10~0 copies/μL的病毒核酸,仅对PDCo V出现扩增曲线,其余病毒均为阴性,且组内及组间变异系数皆小于2.4%。检测239份临床样品,其阳性率为5.43%。3.PDCo V N蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备构建p ET-28a（+）-N重组质粒进行表达,经SDS-PAG电泳鉴定该重组蛋白大小约为44k Da;对重组蛋白表达条件进行优化,结果显示在温度为30℃、IPTG终浓度为0.8 m M、表达时间为3 h,携带重组质粒的Transetta菌株表达量最大,重组蛋白均能在上清和包涵体中表达,且上清表达量明显较大,遂选择Ni+亲和层析法对蛋白上清进行纯化并利用超滤管浓缩蛋白,经鉴定后获得了浓度为0.78 mg/m L的重组蛋白。免疫家兔制备了效价可以达到1:204800的多克隆抗体。4.PDCo V N蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用以纯化的N蛋白为基础,构建PDCo V间接ELISA方法。通过优化确定了ELISA反应条件,抗原包被浓度达到1.0μg/m L,血清稀释度为1:100,酶标二抗稀释度为1:4000,其检测效果最佳;判定标准为OD450≥0.201。与PEDV、PRSSV、JEV、HPS等阳性血清无交叉反应;其灵敏性可以达到检测稀释1600倍的阳性血清;在重复性试验中,批内和批间变异系数皆小于10%。利用该方法检测四川地区收集的387份血清样品,其阳性率0.26%。本研究建立的间接ELISA方法具有特异性强、简单、快速等特点,可用于PDCo V抗体的快速检测,而且进一步证实N蛋白作为抗原的可行性。