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实验背景：热疗可通过提高机体免疫效应细胞活性、诱导免疫效应细胞再分布、影响细胞因子表达等作用调节机体的免疫功能,抑制肿瘤生长和转移。含有CpG基序的细菌0DN能够起始免疫刺激级联反应,最终促使多种免疫细胞的成熟分化和增殖,包括B细胞、T细胞、NK、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞,这些细胞分泌多种细胞因子和细胞表面黏附分子,诱导Thl型免疫应答,导致促炎症反应和偏向Thl的免疫应答。树突状细胞(Dendritic cells, DCs)是目前所知的在体内唯一能活化初始T细胞的功能最强大的抗原呈递细胞,是启动特异性抗肿瘤免疫应答的关键。而已有研究表明肥大细胞与树突状细胞活化成熟之间存在密切的联系,因此肥大细胞脱颗粒剂Compound48/80在肿瘤免疫方面的作用日益成为研究热点。中药提取物人参多糖有T细胞佐剂的特性,可明显提高抗体水平,有效剂量范围较宽,毒性小,值得进一步深入研究。随着中药免疫药理学研究不断发展,现已证明数百种中草药有多方面的免疫活性,能影响和调节机体的免疫功能,被认为是理想的生物反应调节剂,尤其是补益类中药的有效成分极有希望开发成为新型疫苗佐剂,而人参多糖正是研究热点之一基于热疗可调节机体免疫功能,研究热疗与各种免疫佐剂联合应用的协同效应,为利用热效应治疗肿瘤提供新的应用方法,二者可取长补短,产生协同作用,从而提高抗肿瘤免疫。实验目的：1.探索并比较CpG寡核苷酸序列、Compound48/80和人参多糖作为免疫佐剂对磁感应热疗肿瘤的作用及优劣。2.探索CpG寡核苷酸序列在免疫方面发挥作用与否及其作用机制实验方法：1.磁纳米颗粒的制备及免疫佐剂修饰：采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁纳米颗粒(MNP),经表面氨基化修饰制备氨基硅烷修饰的磁纳米颗粒即ATPS-MNP,采用不同的方法将两种免疫佐剂对其进行修饰,利用透射电镜、傅立叶红外光谱仪、热重分析等分析手段对磁性纳米颗粒进行形态、粒径等进行表征检测,观察其特性及是否连接成功。2.动物实验：C57BL/6小鼠右后肢接种B16F10小鼠黑色素瘤细胞建立肿瘤模型；实验动物分为五组：阴性对照组、单纯磁热疗组、磁热疗+CpG组、磁热疗+C48/80组、磁热疗+人参多糖组。按剂量戊巴比妥钠麻醉后肿瘤原位注射一定浓度的磁流体或免疫佐剂,交变磁场下进行热疗后,记录生存期和肿瘤体积。3.指标检测：对小鼠心、肝、脾、肺、脑和肿瘤进行HE和普鲁士蓝染色,进行病理学分析; ELISA方法检测小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达及免疫球蛋白G分型IgG1、IgG2a和IgG2b的表达,并计算IgG1/IgG2a探索免疫趋向性。Real time RT-PCR方法检测不同组小鼠组织中Toll样受体即TLR1-9及中间蛋白Myd88的表达,探索免疫佐剂机制。实验结果：1.制备的磁纳米颗粒粒径在10nm左右,在特定交变磁场下具备良好的升温性能；磁纳米颗粒经氨基硅烷修饰后升温性能没有变化。2.动物实验结果表明：单纯热疗组和三个联合热疗组同对照组相比,肿瘤生长受到明显抑制,联合治疗组有部分小鼠肿瘤消退,生存期相比对照组也有明显的延长,并且差异有显著统计学意义(p<0.05)。CpG联合治疗组在三组中治疗效果最为显著,但与单纯热疗组的显著性差异出现在三次热疗结束五天后。3.指标检测：ELISA检测表明相比对照组,单纯热疗组和三个联合治疗组IL-1β、IL-6和TNF-α的表达都有提高,其中IL-1β和TNF-α的差异具有显著性统计学意义；CpG组相比单纯热疗组IL-1β和TNF-α表达显著性提高,IL-6表达有所降低,但是不显著性差异；单纯热疗组和三个联合治疗组同对照组相比,IgG1、IgG2a和IgG2b的表达都有显著性提高,CpG组IgG1/IgG2a相比单纯热疗组比值降低。相比对照组及单纯热疗组,CpG联合治疗组和C48/80联合治疗组TLR2,TLR4和TLR9表达显著增高。Ⅲ实验结论：1.成功制备出磁性纳米粒,粒径10nm左右,安全性好。磁性纳米粒具有良好的升温性能,适合热疗要求。2.50℃×15min的局部热疗剂量磁感应局部热疗能有效抑制荷黑色素瘤小鼠肿瘤体积,延长小鼠生存期。3.免疫佐剂联合组相比单纯热疗组的优势在热疗结束5天后显现出来,可抑制肿瘤生长,延长生存期,并具有提高免疫的长期作用；CpG-ODN作为免疫佐剂作用较为明显,诱导Thl型免疫应答,并依赖Toll样受体途径发挥作用。