【摘 要】
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目的:ALOXE3是脂氧合酶一个重要的亚型,脂氧合酶的其他亚型在多种癌症中表达异常,并且已被证明通过多种途径参与癌症的发生及发展。本研究旨在检测胶质母细胞瘤中ALOXE3的表达水平,明确ALOXE3对胶质母细胞瘤的生物学行为的影响,并进一步探究其相关的调控机制。方法:通过GEPIA中的开放数据库获取ALOXE3的表达情况,实时荧光定量PCR、蛋白印迹实验、免疫组织化学染色分析其在胶质母细胞瘤和正常
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目的:ALOXE3是脂氧合酶一个重要的亚型,脂氧合酶的其他亚型在多种癌症中表达异常,并且已被证明通过多种途径参与癌症的发生及发展。本研究旨在检测胶质母细胞瘤中ALOXE3的表达水平,明确ALOXE3对胶质母细胞瘤的生物学行为的影响,并进一步探究其相关的调控机制。方法:通过GEPIA中的开放数据库获取ALOXE3的表达情况,实时荧光定量PCR、蛋白印迹实验、免疫组织化学染色分析其在胶质母细胞瘤和正常脑组织的中的表达差异,以及其代谢相关产物的水平差异;利用慢病毒载体在人胶质母细胞瘤U87细胞构建ALOXE3敲低的稳定细胞模型,通过裸鼠体内原位成瘤实验,来验证ALOXE3在体内调控胶质母细胞瘤生长的作用;通过台盼蓝染色、Brd U、乳酸脱氢酶释放法实验检测细胞的增殖和活性情况;用实时荧光定量PCR检测细胞和裸鼠瘤体铁死亡的标志物的表达,并通过流式细胞术、实时荧光定量PCR等实验验证ALOXE3的缺失对p53介导的铁死亡的影响;蛋白免疫印迹实验、免疫共沉淀实验以及分析代谢相关产物水平等实验验证p53通过其下游靶基因SLC7A11对ALOXE3的调控;通过划痕实验和Transwell迁移实验来检测细胞的迁移功能及其相关机制。双荧光素酶报告基因实验、蛋白免疫印迹实验以及分析代谢相关产物水平验证miR-18a对ALOXE3的调控。结果:1.通过在线数据库分析和实验验证,与正常脑组织相比,人胶质母细胞瘤组织中ALOXE3的水平是下调的。同时发现相较于对照组,胶质母细胞瘤患者脑脊液中的12-KETE几乎检测不到,而12-HETE水平是升高的。2.裸鼠原位成瘤体内实验验证,ALOXE3敲低后,移植瘤生长速度增快,裸鼠体重减轻、生存时间缩短。3.ALOXE3基因的下调,影响了胶质母细胞瘤细胞的增殖能力和铁死亡。使用p53激活剂可促进铁死亡,而ALOXE3的缺失对p53诱导的铁死亡却不显著。p53激活后,胶质母细胞瘤细胞的细胞培养基中的12-KETE增多而12-HETE下降,SLC7A11在p53激活后是下调的,同时SLC7A11和ALOXE3之间存在相互作用,SLC7A11干扰后破坏了ALOXE3-SLC7A11复合物,此外,SLC7A11的干扰有效地促进胶质母细胞瘤细胞的细胞培养基中12-KETE的分泌。4.敲低ALOXE3基因,影响了胶质母细胞瘤细胞的迁移能力,同时ALOXE3敲低使细胞条件培养基12-KETE（受ALOXE3直接调节的代谢产物）的分泌减少而12-HETE（受ALOXE3间接调节的代谢产物）的分泌增多,从而影响了胶质母细胞瘤细胞的迁移能力。使用了ML355后（其可以阻断12-HETE的产生）,发现这种现象可以得到逆转。最后,胶质母细胞瘤细胞用12-HETE处理后结果显示12-HETE可以影响细胞的迁移能力。5.双荧光素酶报告基因实验证明miR-18a降低了用野生型ALOXE3 3’UTR转染的胶质母细胞瘤细胞中的荧光素酶活性,Western-blot实验验证在miR-18a模拟物处理后,ALOXE3的蛋白质水平在胶质母细胞瘤细胞中显著下调,同时12-KETE减少和12-HETE产生增加。结论:1.GBM患者癌组织的ALOXE3表达水平低于正常脑组织。2.ALOXE3缺乏促进了裸鼠GBM的恶性进展。3.ALOXE3下调可以增强GBM细胞的增殖能力、抑制细胞的铁死亡,并对p53诱导的铁死亡具有一定程度的抵抗。p53可以通过负调节SLC7A11间接促进ALOXE3的脂氧合酶活性。4.ALOXE3下调可以通过调控12-HETE的分泌增强GBM细胞的迁移能力。5.miR-18a直接靶向ALOXE3并抑制其在GBM细胞中的表达和活性。
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