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目的:在胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)中,Nanog 与 OCT4,SOX2 共同维持胚胎干细胞的自我更新和多潜能性,被认为是胚胎干细胞的标志物之一。最初认为Nanog只在ESC等多能性细胞中表达,在成体组织中不表达。然而最近的研究发现Nanog在一些癌细胞中也有表达(乳腺癌、卵巢癌、结直肠肠癌等)。鉴于癌细胞与ESC均有无限增殖及保持低分化状态的特征,提示Nanog可能是调节癌细胞全能性与自我更新的关键因子。最近又有研究表明在肿瘤细胞中发挥作用的Nanog主要来自其假基因NanogP8。本研究应用分子克隆技术,构建NanogP8真核表达质粒,通过转染细胞获得NanogP8高表达的乳腺癌细胞系,发现NanogP8的高表达能够促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力;应用免疫共沉淀技术结合蛋白质谱分析与NanogP8相互作用的蛋白质,进一步通过免疫共沉淀技术结合Western Blot发现Ebp1与NanogP8存在相互作用,并通过shRNA技术干扰乳腺癌细胞系中Ebp1的表达水平,发现Ebp1表达下调能够促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。又进一步研究NanogP8与Ebp1对各自表达水平、定位及活性的影响。从而探索NanogP8在调节人乳腺癌细胞增殖中的作用机制。方法:1.应用Western Blot技术检测乳腺癌细胞系中Nanog的表达情况,采用PCR的方法克隆MCF-7细胞系中的Nanog,测序后通过Blast程序进行基因比对。2.应用分子克隆技术构建带有Flag标签的NanogP8真核表达质粒,采用Western Blot技术检测NanogP8的表达及免疫荧光技术检测NanogP8的定位。3.采用G418筛选NanogP8高表达的乳腺癌细胞系。应用MTT、克隆形成实验检测Nanog P8高表达对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。4.应用划痕实验和Transwell体外侵袭实验检测NanogP8高表达对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响。5.应用免疫共沉淀结合质谱分析找出并鉴定与NanogP8潜在相互作用的蛋白,并对与NanogP8潜在相互作用的蛋白进行Gene Ontology(GO)功能分析,Signaling Pathway信号通路分析及蛋白网络图的解析。6.应用免疫共沉淀技术验证Ebp1与NanogP8存在相互作用。7.应用MTT、克隆形成实验检测Ebp1降表达对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。8.应用划痕实验和Transwell体外侵袭实验检测Ebp1降表达对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响。9.应用Western Blot技术检测Ebp1基因降表达对细胞周期蛋白CyclinD1和NanogP8蛋白表达水平的影响以及NanogP8基因高表达对Ebp1蛋白表达水平的影响。10.应用免疫荧光技术检测Ebp1基因降表达对NanogP8蛋白定位的影响和NanogP8基因高表达对Ebp1蛋白定位的影响。结果:1.Western Blot检测发现Nanog在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中表达,在SK-BR3、T47D中不表达。测序后基因比对分析发现,MCF-7中的Nanog来自其假基因NanogP8。2.Western Blot检测发现Flag-NanogP8能够在细胞内正常表达,免疫荧光染色的结果显示Flag-NanogP8定位于细胞核,即Flag不会影响NanogP8的表达和定位。3.Western Blot检测证实成功获得NanogP8高表达的稳定细胞系,NanogP8表达水平升高后,MDA-MB-231细胞的增殖能力显著增强(P<0.05)。4.NanogP8表达水平上调后,明显促进了 MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。5.利用GO、Signaling Pathway功能分析及蛋白网络图的结果筛选与NanogP8相互作用的蛋白。6.利用免疫共沉淀证实NanogP8与Ebp1间存在相互作用。7.Ebp1表达水平下降后,MDA-MB-231细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。8.Ebp1表达水平下降后,MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力显著增强(P<0.05)。9.Western Blot检测发现Ebp1基因沉默后,CyclinD1的表达水平显著升高,但NanogP8的蛋白表达量无明显变化,且NanogP8高表达后,Ebp1的蛋白表达量也无明显变化。10.免疫荧光技术检测Ebp1基因沉默后,NanogP8的定位无明显变化,NanogP8基因高表达后,Ebp1的定位无明显变化。结论:1.Nanog在部分乳腺癌细胞中存在表达,而且主要来源于Nanog的假基因NanogP8的转录产物。2.NanogP8蛋白表达水平升高后,乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖能力明显增强,迁移能力和体外侵袭能力也显著增强。3.Ebp1是NanogP8的一个新的相互作用蛋白。4.Ebp1表达水平降低后,乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖能力明显加强,迁移能力和体外侵袭能力也显著增强。5.Ebp1表达水平降低对NanogP8蛋白表达水平和细胞定位没有显著影响;而且NanogP8对Ebp1蛋白表达水平和细胞定位也未见明显影响。