论文部分内容阅读
杂环胺（HAAs）是指鱼、红肉、禽肉等高蛋白食物,在热加工过程中形成的一种产生致癌性和致突变等特征的多环芳香族化合物。HAAs的摄入量与相关癌症风险之间的关系的评估是目前流行病学研究的热点。由于人们的饮食结构不同,食物的烹饪方法的差异等因素,尚无法对日常杂环胺的摄入进行有效定量。因而需要选择和确定合适的生物标记物对杂环胺的摄入进行评估,以探索HAAs的摄入水平与相关癌症风险之间的关系。HAAs进入人体后,经过系列反应产生的代谢物能与人血清白蛋白（HSA）结合生成HAA-HSA亚磺酰胺加合物。2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶（PhIP）是煎烤红肉中产生最多的一种HAA。本课题选用PhIP-HSA亚磺酰胺加合物为生物标记物,并构建出对人类血浆中的PhIP-HSA亚磺酰胺加合物质开展定性定量研究的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法,以深入地研究食物中PhIP的摄入量和相关癌症风险之间的关联。研究分为以下三个部分:（1）建立和优化人体血浆中PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的定量分析方法PhIP-HSA亚磺酰胺加合物在弱酸性环境下易水解分离出相应的PhIP。通过对PhIP的检测可以定量人血中PhIP-HSA亚磺酰胺加合物,进而用以评估杂环胺的摄入。PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的制备方法是通过体外合成PhIP的N-氧化代谢物2-硝基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶（NO2-PhIP）和2-羟基氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶（HONH-PhIP）与HSA反应生成的。PhIP-HSA亚磺酰胺加合物是通过对其酶水解产生的含PhIP肽链和其酸水解产生的PhIP检测定量的。两种方法对比发现,检测酸水解产物PhIP的方法灵敏度要远高于检测含PhIP肽链。因而,UPLC-MS/MS检测PhIP-HSA亚磺酰胺加合物酸水解产物PhIP的方法用于评估人血中PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的含量。通过选择不同亲和柱及优化萃取条件,提高了人血中HSA的提取率;同时通过优化酸水解条件有效提升了酸水解效率。结果显示,优化的酸水解条件为:盐酸浓度0.16 M;反应时间:1 h。酸水解效率高达96%。同日及异日分析的所有样品中内标[~2H3]-PhIP的回收率均在70～77%之间,表明该检测方法重复性好。不同浓度PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的含量与PhIP的信号强度呈现线性正相关,y=1.0117x+3.2563,R~2=0.9987。PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的实际检测量与理论添加量的差异小于13%。检测限低至0.005 fmol/mg HSA,定量限低至0.015 fmol/mg HSA。因此,该方法具有较高的灵敏度,可以对人体内极低含量的PhIP-HSA亚磺酰胺加合物进行检测。（2）人血液中游离的PhIP的检测方法的建立及定量研究食物中的PhIP进入人体后,经系列代谢,与血浆中的HSA相结合生成PhIP-HSA亚磺酰胺加合物,部分PhIP可能未参与代谢,游离存在于血液中,随后排出体外。通过对血液中PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的检测仅能反映参与代谢部分的PhIP,所以对未血液中未参与代谢的PhIP进行分析评估,有助于全面评估PhIP的摄入情况。血液中游离PhIP的检测是通过先去除血浆中的蛋白质,而后采用SPE进行富集纯化,使用UPLC-MS/MS检测进行定量分析。结果显示乙醇含量为90%时沉降效果最好。方法的标准曲线为y=2E+06x-5406.1,R~2=0.9999,回收率在73.09～88.42%之间,检测限低至0.003 fmol/m L血浆,定量限低至0.009 fmol/m L血浆。对直肠癌患者（15个）、结肠癌患者（3个）的人体血浆样本进行了分析。所有人体血浆样本中均未检测到PhIP。这说明人体血浆中游离PhIP的含量低于方法的检测限。（3）人体血液中PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的定量研究采集正常人（15个）、直肠癌患者（15个）、结肠癌患者（12个）、混合（10个）血浆样本,混合样本与单个样本等量,由4个癌症患者的血浆样本组成。使用优化的UPLC-MS/MS检测方法评估人血浆样本中PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的含量。结果显示,健康人的血液中均未检测到PhIP-HSA亚磺酰胺加合物。检测到PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的样本有直肠癌血浆样本（4个）、结肠癌血浆样本（2个）、直肠癌血浆混合样本（2个）、结肠癌血浆混合样本（3个）。这些血浆样本中PhIP-HSA亚磺酰胺加合物的含量在0.12～0.23 fmol/mg HSA。在16%（6/37）的癌症患者的血液中检测到了PhIP-HSA亚磺酰胺加合物,说明使用PhIP-HSA亚磺酰胺加合物作为生物标记物研究杂环胺的摄入与相关癌症分析有一定的可行性。