论文部分内容阅读
冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary atherosclerotic heart disease），简称冠心病，是引起人类死亡的主要原因之一。冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变与血管内皮细胞增殖、炎症细胞浸润密切相关，进而出现管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。临床症状与疾病程度有明显相关性，患者可不同程度的表现心前区不适、心悸、心绞痛，甚至心力衰竭、猝死。白细胞介素8（Interleukin-8,IL-8）是一种多细胞源性细胞因子，可由浸润的单核细胞、巨噬细胞及活化的内皮细胞分泌，进一步募集中性粒细胞聚集、诱导粘附分子及趋化因子表达，以对抗感染的病原菌和组织损伤。研究表明冠心病患者外周血IL-8水平明显高于健康对照者，且急性期患者高于缓解期患者，IL-8的表达水平与冠状动脉狭窄程度呈现正相关。血管粘附分子-1(VCAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是粘附分子家族中的重要成员，可介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间相互作用，进而参与细胞增值、迁移等功能的调控。研究表明，冠心病患者伴随细胞粘附分子表达增加，其随访死亡率明显高于粘附分子表达正常的患者。本实验拟采用人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)为模型，在体外培养及基础上分析IL-8对血管内皮细胞多种炎症细胞因子分泌的影响，如IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α等，同时分析IL-8对HUVEC细胞粘附分子表达的影响，通过阻断IL-8R，进一步探讨IL-8对血管内皮细胞功能影响的机制，为阐述冠心病发病机制及阻断IL-8/IL-8R通路治疗冠心病提供一定理论依据。 目的:本实验拟采用人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)为模型，分析IL-8对血管内皮细胞多种炎症细胞因子分泌的影响，同时分析IL-8对HUVEC细胞粘附分子表达的影响，通过阻断IL-8R，进一步探讨IL-8对血管内皮细胞功能影响的机制，为阐述冠心病发病机制及阻断IL-8/IL-8R通路治疗冠心病提供一定理论依据。 方法：1.IL-8刺激HUVEC细胞增殖检测：分别采用不同浓度梯度包括1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml浓度IL-8刺激HUVEC细胞，24h后观察细胞形态，并用MTT法检测细胞增殖情况。 2.ELISA法检测HUVEC细胞炎症细胞因子分泌：选取HUVEC细胞铺板，每孔1ml，细胞浓度5×105/ml，加入4ng/ml浓度IL-8刺激24h，采用ELISA法检测培养上清IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α浓度。 3.免疫荧光结合激光共聚焦检测HUVEC细胞粘附分子表达：HUVEC细胞经IL-8刺激后，采用免疫荧光结合激光共聚焦检测HUVEC细胞VCAM-1和ICAM-1表达情况。 4.IL-8R抗体抑制HUVEC细胞炎症因子分泌：在培养体系中加入IL-8后，再加入IL-8R抗体，以封闭IL-8R进而阻断IL-8的结合。刺激后采用采用ELISA法检测培养上清IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α浓度。 5.IL-8R抗体抑制HUVEC细胞粘附分子表达：在培养体系中加入IL-8后，再加入IL-8R抗体，以封闭IL-8R进而阻断IL-8的结合。采用免疫荧光结合激光共聚焦检测HUVEC细胞VCAM-1和ICAM-1表达情况。 6.统计学方法：计量数据以均数加减标准差（(x)±s）表示，两组间差异比较采用t检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：1.IL-8刺激HUVEC细胞增殖：采用不同浓度梯度包括1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml浓度IL-8刺激HUVEC细胞，在IL-8浓度小于8ng/ml时，随着IL-8浓度增加，HUVEC细胞增殖率呈现上升趋势。 2.IL-8刺激HUVEC细胞炎症因子分泌：HUVEC细胞经IL-8刺激后，培养上清中IL-4和IL-6浓度分别为（1.62±0.33）ng/ml和（4.23±1.03）ng/ml，均高于空白组上清IL-4和IL-6浓度，且有统计学差异；刺激后上清IL-2、IFN-γ和TNF-α浓度分别为（0.54±0.16）ng/ml、（0.88±0.22）ng/ml和（0.36±0.10）ng/ml，与空白组相比无统计学差异。 3.IL-8刺激HUVEC细胞粘附分子表达：HUVEC细胞经IL-8刺激后，细胞表面VCAM-1和ICAM-1表达增加。 4.IL-8R抗体抑制HUVEC细胞炎症因子分泌：加入IL-8R受体阻断后培养上清IL-4和IL-6浓度为（0.79±0.10）ng/ml和（1.52±0.12）ng/ml，均低于未加入IL-8R抗体组IL-4和IL-6浓度（1.62±0.33）ng/ml和（4.23±1.03）ng/ml，且有统计学差异。加入IL-8R受体阻断后培养上清IL-2、IFN-γ、TNF-α浓度分别为（0.36±0.06）ng/ml、（0.81±0.12）ng/ml和（0.31±0.14）ng/ml，与为加入抗体组相比无统计学差异。 5.IL-8R抗体抑制HUVEC细胞粘附分子表达：加入IL-8R抗体组VCAM和ICAM相对荧光强度分别为（15.71±5.17）和（34.26±5.34），未加入IL-8R抗体组VCAM和ICAM相对荧光强度分别为（103.11±11.53）和（61.99±9.36），后者较前组相比两个粘附分子表达均增加，且有统计学差异。 结论：1.IL-8能刺激人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)增殖，且能促进其炎症因子IL-4、IL-6的分泌，同时促进其粘附分子VCAM-1和ICAM-1表达。 2．IL-8主要通过与IL-8R受体结合进而影响HUVEC细胞功能，采用IL-8R抗体阻断可抑制HUVEC细胞IL-4、IL-6分泌及VCAM-1和ICAM-1表达。