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帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)是发生于中老年期以中脑黑质纹状体多巴胺(dopa, DA)能神经元变性坏死为特征的神经系统退行性疾病。其临床症状主要以运动迟缓、静止性震颤、肌张力增高(肌强直)与姿势步态异常等为特征。目前治疗帕金森氏病的方法主要是通过药物补充多巴胺或外科手术缓解症状,这些方法存在一定的副作用和风险,并且未从根本上恢复病灶部位的正常功能。因此,治疗PD应该寻找一种既安全、又能缓解症状,并从根本上恢复黑质纹状体系统功能的治疗方法。利用干细胞治疗PD是一种新的思路。在这项研究中,我们将诱导分化为多巴胺能神经元样细胞并表达Lmx1α和NTN基因的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)植入PD模型猴病变部位进行PD治疗的探索。LIM homebox transcription factor1alpha (Lmxla)在中枢神经系统胚胎发育过程中对中脑多巴胺能神经元的形成起重要调控作用;Neurturin (NTN)对多巴胺能神经元具有明显的营养和保护作用。因此,本研究选择了Lmx1α和NTN两个基因分别作为诱导分化基因和营养保护基因,通过重组腺病毒传递两个基因,对hUC-MSCs进行基因修饰,使其表达Lmx1α和NTN蛋白,同时添加Lmx1α调控因子—音猬因子SHH以及其他诱导剂以提高hUC-MSCs向多巴胺能神经元细胞诱导分化效率。然后将诱导分化后的细胞移植进入帕金森氏病模型猴脑内病变部位进行治疗。实验结果表明,体外分离培养的hUC-MSCs表达CD29、CD44、CD49d表面抗原,不表达CD45、CD34以及HLA-DR,说明分离培养的细胞为源于脐带组织的间充质干细胞。经重组腺病毒感染的hUC-MSCs,使用RT-PCR方法检测到Lmx1α和NTN基因在hUC-MSCs中转录;免疫荧光和Western Blot结果表明Lmx1α和NTN在hUC-MSCs中有较强的表达;在培养基上清液中也可以检测到成熟NTN的分泌产物。体外试验证明,表达的NTN可以维持胎鼠中脑多巴胺能神经元存活。研究中还摸索了最佳外源及内源性诱导因素对hUC-MSCs诱导的条件,提高了hUC-MSCs细胞内部发生重编程而向多巴胺能神经元细胞方向分化的效率。诱导后的dUC-MSCs经Real-time PCR检测,结果显示,神经元特异性基因TH、Pitx3、EN等的转录上调,初步说明hUC-MSCs被诱导成为多巴胺能神经元样细胞。免疫荧光检测结果也证明诱导后的细胞有TH、β-tubulinⅢ、NSE、Nestin、MAP-2蛋白的表达,这些特异性产物的表达说明:hUC-MSCs已诱导成为多巴胺能神经元样细胞。为了验证诱导后的神经元样细胞的体内生理活性,我们将诱导后并标记了BrdU的神经元样细胞移植至帕金森氏病模型猴的黑质(SN)、尾状核(Pu)和壳状核(Cd)三个核团进行治疗并评价其治疗效果。治疗前,我们对所造单侧恒河猴帕金森氏病模型进行有效性和时效性的评价。通过六个月的试验观察,在确认模型动物无自发恢复的前提下,进行细胞移植治疗。实验动物分为三组:正常实验动物组、HBSS对照组、诱导后细胞移植治疗组。通过核磁共振(MRI)定位APO、SN、Pu、Cd区域坐标,利用立体定位注射技术将体外诱导分化且标记了BrdU的hUC-MSCs定向移植到帕金森氏病模型猴中脑黑质以及纹状体相应核团中进行治疗。对移植后模型动物的评价包括行为恢复评价、SPECT多巴胺转运蛋白显像评价以及生理恢复评价。经综合评价发现,细胞移植治疗组在治疗后特异性PD症状有明显好转,而对照组PD症状没有恢复。行为学评价后,实验动物实施安乐死,对相应的脑组织进行切片HE染色、TH以及BrdU免疫组化检测结果均证明移植进入动物脑内的多巴胺能神经元样细胞可存活,且该神经元样细胞来源于诱导后的hUC-MSCs。通过本研究发现,Lmx1α在促使hUC-MSCs向多巴胺能神经元样细胞分化过程中有重要作用,表达Lmx1α的hUC-MSCs在NTN的营养保护作用下,以及在SHH、 FGF-8等细胞因子诱导条件下可以分化成为能够表达多巴胺能神经元特异性标记分子的神经元样细胞。分化的多巴胺能神经元样细胞移植到帕金森氏病模型猴脑靶部位后,一方面可以参与局部组织修复整合,重构纹状体,行使细胞的替代功能,恢复多巴胺的释放,从而显著改善实验猴帕金森症状;另一方面由于移植的神经元细胞本身表达Lmx1α、NTN和分泌的可溶性物质为局部脑组织中的神经干细胞提供了促其分化的微环境,使得内源性神经干细胞被激活并向神经元分化;内源性分泌的NTN进一步对诱导成的多巴胺能神经元细胞和由神经干细胞分化成的神经元细胞产生营养保护作用,形成良性循环而发挥治疗作用。此项研究提示,利用Lmx1α和NTN将hUC-MSCs诱导分化成多巴胺能神经元样细胞能够在帕金森氏病早期发挥治疗作用,缓解其发病进程,这为细胞移植治疗帕金森氏病提供了新的思路和科学依据,关于疗效的持久性还需要做进一步深入细致和长期的观察研究。