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机体的免疫系统具有免疫监视能力,可以通过固有免疫和适应性免疫控制肿瘤的发生与进展。肿瘤免疫治疗主要通过干预手段,激发和调动机体的免疫系统,增强抗肿瘤免疫应答,从而杀伤肿瘤细胞。CD8+T细胞在适应性免疫应答环节中对抑制与杀伤肿瘤起核心作用,但其活性往往在肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中受到抑制,出现功能失调或耗竭,失去增殖、产生细胞因子和溶解肿瘤细胞的能力,因而重新激活CD8+ T细胞的细胞毒性在肿瘤免疫治疗中具有重要的临床意义。细胞因子介导肿瘤微环境中免疫细胞之间或其与非免疫细胞之间的相互作用,在机体免疫调节中发挥重要作用。其中转化生长因子β（Transforming growth factor-β,TGF-β）是机体免疫应答的负性调控分子,在肿瘤进展后期不仅能够直接抑制T细胞的增殖、活化和效应功能,还可以通过髓系来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSC）、肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophage,TAM）和调节性 T 细胞（Regulatory T cells,Treg）等免疫抑制性细胞形成抑制性微环境,进一步抑制免疫细胞的功能,介导肿瘤免疫逃逸。白细胞介素-36γ（Interleukin-36γ,IL-36γ）是一种有效的抗肿瘤细胞因子,可介导Ⅰ型免疫应答,增加免疫细胞在肿瘤中的浸润,促进T细胞的增殖和效应功能,改变肿瘤微环境,在多种肿瘤模型中具有显著的抗肿瘤作用。以细胞因子为靶点的肿瘤免疫治疗策略虽然在多种动物肿瘤模型中取得了不错的进展,但其单药应用在临床测试中仍存在障碍和挑战,如反应率有限、无法预测临床疗效以及潜在的副作用等,阻碍了免疫疗法在临床的进一步应用。TGF-β与细胞程序性死亡受体1（Programmed cell death 1,PD-1）等免疫检查点分子阻断疗法的联合由于TGF-β靶点的特殊性和其在肿瘤中的双重作用而进展受挫,但其与细胞因子的联合显示出良好前景。有文献报道白细胞介素-33（Interleukin-33,IL-33）能够通过巨噬细胞增强TGF-β信号,而TGF-β的增加反过来会导致IL-33表达的上调。IL-33与TGF-β间的前馈环路提示我们应当深入理解促肿瘤免疫应答细胞因子和TGF-β及其与肿瘤微环境之间的相互作用,并进一步探究细胞因子和TGF-β阻断治疗的联合能否促进肿瘤免疫应答效应。因此,本研究旨在通过荷瘤小鼠模型,分析肿瘤中细胞因子IL-36γ的表达对肿瘤微环境中包括TGF-β及其受体等主要分子表达的影响,论证IL-36γ和TGF-β阻断型抗体的联合应用对肿瘤免疫应答的协同促进效应,探究IL-36γ联合TGF-β阻断型抗体对肿瘤免疫应答中主要免疫细胞群体数量和功能的影响,以期为肿瘤免疫联合治疗提供新的组合手段。[目的]分析IL-36γ对肿瘤微环境中TGF-β及其受体在T细胞表达的影响,探究IL-36γ联合TGF-β抗体促进肿瘤免疫应答的效应与机制。[方法]利用转录组测序比较分析B16vector和B16IL-36y荷瘤小鼠肿瘤组织中相关细胞因子、共刺激分子和免疫检查点分子等基因的表达。构建4T1乳腺癌移植瘤和B16黑色素瘤荷瘤小鼠模型,在Day 2每三天腹腔注射IgG和TGF-β抗体;当采用PD-L1抗体进行联合干预时,从Day 11开始每三天腹腔注射PD-L1抗体;测量小鼠肿瘤生长大小,绘制肿瘤生长曲线。在肿瘤生长中、晚期取荷瘤小鼠肿瘤、脾脏和引流淋巴结组织,经流式细胞术分析主要免疫细胞群体CD45+细胞、CD4+T和CD8+T细胞、Treg细胞、MDSC及其亚群的浸润情况,并检测CD4+T和CD8+T淋巴细胞中CD44、CD62L、Ki-67、IFN-γ、TNF-α、T-bet、Eomes、PD-1、CXCR5、MDSC及其亚群中MHC-Ⅱ、CD206等分子的表达。抽提肿瘤组织中的RNA,逆转录后利用Real-time PCR技术检测TGF-β及其受体、IFN-γ、TNF-α、Perforin和GzmB等分子在mRNA水平的变化。设计离体杀伤实验,利用免疫磁珠法分选荷瘤小鼠脾脏中的CD8+T细胞和正常小鼠中的抗原递呈细胞（Antigen-presenting cell,APC）,加或不加经辐照处理过的4T1肿瘤细胞,并在IL-2存在的条件下共培养后收取上清检测IFN-γ分泌情况。ELISA检测肿瘤上清中TGF-β的浓度和离体杀伤实验细胞培养上清中IFN-γ浓度。体外不同条件诱导培养CD4+Treg细胞,并经流式细胞术检测细胞中Foxp3的表达。[结果]本文通过研究,获得如下结果:1.IL-36γ促进了肿瘤微环境中TGF-β的分泌及其受体TGF-βRⅡ在T细胞的表达;与IL-36γ、TGF-β抗体单独治疗相比,IL-36γ联合TGF-β抗体可显著抑制小鼠模型中黑色素瘤和乳腺癌的生长。2.与IL-36γ、TGF-β抗体单独处理组相比,IL-36γ联合TGF-β抗体可显著增加肿瘤中CD45+细胞、CD4+T和CD8+T淋巴细胞的数量,促进肿瘤CD4+T和CD8+T淋巴细胞中效应性细胞因子的表达,改变各组织中CD44+ CD62+、CD44+CD62L-和CD44-CD62L+T淋巴细胞的比例,并上调T细胞中转录因子T-bet的表达和下调Eomes的表达。3.与IL-36γ、TGF-β抗体单独处理组相比,IL-36γ联合TGF-β抗体可抑制肿瘤CD4+T淋巴细胞中Foxp3的表达,下调CD4+Treg的比例。4.与IL-36γ、TGF-β抗体单独处理组相比,IL-36γ联合TGF-β抗体可影响荷瘤小鼠中MDSC及其亚群的比例和功能,下调MDSC及其亚群M-MDSC、TAM的比例,促进亚群M-MDSC中MHC-Ⅱ分子的表达,抑制M2型TAM的分化。5.与IL-36γ、TGF-β抗体单独处理组相比,IL-36γ联合TGF-β抗体可增加荷瘤小鼠中干细胞样PD-1+CXCR5+TIM-3-T细胞的数量,联合PD-L1抗体阻断治疗可进一步抑制肿瘤生长。[结论]IL-36γ在促进肿瘤免疫应答的同时,上调了肿瘤微环境中TGF-β/TGF-βR信号。与IL-36γ或TGF-β抗体单独处理相比,IL-36γ联合TGF-β抗体显著增加CD4+TILs和CD8+TILs数量,促进其IFN-γ、Perforin和GzmB等效应性细胞因子的表达,下调肿瘤中CD4+Treg的比例,同时下调MDSC及其亚群M-MDSC、TAM的比例,抑制M2型TAM的分化,并增加荷瘤小鼠中干细胞样PD-1+CXCR5+TIM-3-T细胞的数量,从而显著抑制肿瘤的生长。