第一部分遗传性高钙尿结石形成大鼠肾脏miRNA-mRNA表达网络分析目的全面了解遗传性高钙尿结石形成大鼠肾脏miRNA及mRNA的表达变化及其相互作用关系。方法采用高通量miRNA及mRNA生物芯片技术,寻找出在遗传性高钙尿结石形成大鼠(GHS大鼠)与Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)肾脏差异表达的miRNA及mRNA。通过miRanda数据库,预测miRNA的靶基因,选取预测的靶基因与实际表达差异的交集基因进行生物信息学的分析。通过GO分析和KEGG pathways分析寻找差异基因可能富集的功能和信号通路,并最终根据差异miRNA和mRNA构建出miRNA-mRNA调控网络和细胞信号通路调控网络(signal-net)。结果通过生物芯片检测,共发现2418个在GHS大鼠和SD大鼠肾脏内差异表达的mRNA和19个差异表达的miRNA。选取miRNA的预测靶基因和2418个差异表达基因的交集做GO和KEGG pathways分析,共得到703个明显富集的GO terms(包括417个上调和286个下调)以及83个明显富集的pathways(包括75个上调和18个下调)。成功构建miRNA-mRNA调控网络,通过网络分析发现,rno-miR-674-5p, rno-miR-672-5p, rno-miR-138-5p and rno-miR-21-3p可能是调控网络的核心,而Sema5a, Lpin2, Gcntl, Masp1,Olrl和Traf3等基因在网络中有最高的连接度。此外,还成功构建差异表达的细胞信号通路网络,并发现NFκB家族分子在特发性高钙尿大鼠肾脏细胞信号通路调节中发挥核心作用。结论本研究成功鉴定了GHS大鼠肾脏内差异表达的miRNA和mRNA,并构建了GHS大鼠肾脏miRNA-mRNA调控网络和信号通路网络,为特发性高钙尿结石病肾脏基因水平发生的改变提供了一个全局观：同时也发现miRNA可能在该病病理生理过程中发挥重要作用,而NFκB信号通路及其下游分子的改变则是该病的核心。本项目为今后关于特发性高钙尿结石病的深入研究提供了方向。第二部分Ca2+激活肾小管上皮细胞ROS/NFκB信号通路促进细胞黏附分子表达目的探讨高钙尿环境对肾小管上皮细胞表面黏附分子表达和草酸钙晶体黏附的影响及其作用机制方法取GHS大鼠及SD大鼠肾脏组织,采用qRT-PCR, western blot,免疫组化检测大鼠肾脏组织细胞内黏附分子ICAM-1, VCAM-1及IL-6的表达水平,用ELISA方法检测大鼠血浆ICAM-1, VCAM-1及IL-6水平；并用western blot检测NFκB相关分子p65和IKB表达水平和磷酸化水平；腹腔注射乙醛酸诱导大鼠肾脏成石,von-kossal染色观察草酸钙晶体在肾小管管腔内的黏附情况。酶消化贴壁法培养GHS大鼠原代肾小管上皮细胞,并用流式细胞术鉴定细胞表面免疫标记CK-18, CK-19及E-cadherin。用Ca2+处理GHS大鼠原代肾小管上皮细胞和NRK-52E细胞,钙离子探针观察Ca2+内流情况；活性氧(ROS)探针观察细胞内ROS生成情况；qRT-PCR, western blot检测黏附分子表达水平和NFκB相关分子表达水平和磷酸化水平；免疫荧光检测p65表达分布变化；草酸钙悬液孵育细胞,观察细胞表面晶体黏附情况；透射电镜观察Ca2+处理前后细胞微结构改变。分别用ROS清除剂NAC和NFκB核转运抑制剂BAY 11-7082预处理细胞,之后用Ca2+处理细胞,观察细胞内上述指标变化,旨在证实细胞内ROS生成和NFκB信号通路在Ca2+刺激诱导的细胞粘附分子表达和草酸钙晶体黏附过程中的作用。结果GHS大鼠肾脏组织内黏附分子ICAM-1, VCAM-1及IL-6的表达水平明显高于普通SD大鼠,GHS血清中ICAM-1, VCAM-1及IL-6的表达也明显高于SD大鼠；western blot检测结果显示,GHS大鼠肾脏组织内p65和IκBα磷酸化水平明显增高,乙醛酸诱导GHS大鼠肾小管内草酸钙晶体生成明显多于SD大鼠。成功培育GHS大鼠原代肾小管上皮细胞。高钙环境可促使细胞内Ca2+含量增加,并诱导细胞内ROS产生增加。Ca2+还能促进细胞黏附分子表达增加,促进NFκB信号通路相关分子p65和IKBα的磷酸化及p65的核转运。NAC能降低细胞内的ROS的水平,并抑制NFκB分子的磷酸化,细胞黏附分子的表达和草酸钙晶体在细胞表面的黏附。BAY 11-7082亦可以抑制NRK一52E细胞黏附分子的表达和草酸钙晶体在细胞表面的黏附。结论高Ca2+环境刺激可引起肾小管上皮细胞内ROS的产生增加,进一步激活细胞内NFκB信号通路,引起其下游黏附分子(包括ICAM-1,VCAM-1及IL-6等)产生增加,增加的黏附分子可介导草酸钙晶体在肾小管上皮细胞胞膜表面的黏附和生长。