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奶牛热应激一直影响着奶牛业的发展.给奶牛业造成严重损失。HSP70作为分子伴侣在正常和应激条件下对机体的生理机能发挥重要作用,CHIP具有E3泛素链接酶活性,与分子伴侣HSP70相互作用在泛素蛋白酶降解系统中发挥重要作用。本试验选择了中国荷斯坦牛为试验材料,以hsp70基因和chip基因作为功能候选基因进行研究,通过单核苷酸多态性和统计模型分析,以期为中国荷斯坦牛育种提供分子标记辅助选择的依据。试验采集427头系谱资料齐全、生产记录完整的中国荷斯坦牛血样,并采集两头身体健康的荷斯坦奶牛的组织,包括心脏,肌肉,肝脏,脾脏和肾脏。利用PCR-SSCP,PCR-RFLP,CRS-RFLP技术对HSP70基因和CHIP基因的多态性进行研究,利用FQ-PCR技术检测chip和hsp70基因在不同组织中的mRNA表达水平。
对hsp70基因外显子部分序列进行扩增,测序结果表明:在1524位点发现G/A突变,但未导致所编码的氨基酸序列发生改变。PCR-RELP结果发现AA,AB两种基因型,A等位基因占主要优势,属于低度多态,不是理想的分子标记。群体遗传学分析表明,该位点达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。扩增chip全基因序列,在719位点第一内含子上发现C/T突变,在1014位点第二内含子上发现T缺失,1407位点第四外显子上发现T插入并引起所编码的氨基酸179位置移码突变。1014位点T缺失无酶切位点进行检测。PCR-RELP,CRS-RFLP结果发现719,1407两个位点均存在三种基因型,A、B两种等位基因所占比例均近似相同。群体遗传学分析表明这两个位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05),在所研究的群体中,处于中度多态。FQ-PCR结果表明,hsp70基因mRNA在肝脏中表达最高,chip基因mRNA在心脏中表达最高,三个位点中只有chip基因1407位点在两头牛中存在不同基因型,分别是AB、BB型,其中BB型个体CHIP表达量高于AB基因型个体。
利用SAS8.0软件,对hsp70和chip基因的3个多态位点的基因型与直肠温度和红细胞钾浓度进行相关分析。结果表明:hsp70基因1524位点AA型个体红细胞浓度显著高于AB型个体,但该位点属于低度多态所以有待于扩大样品量进行证实;chip基因719位点不同基因型对直肠温度和红细胞钾浓度没有显著差异,1407位点不同基因型的直肠温度没显著差异,而对红细胞钾浓度BB基因型显著低于AA和AB两个基因型。通过以上结果说明chip基因1407位点BB基因型个体可能会有更好的抗热应激潜力。