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本论文首先选取健康BALB/c小鼠,建立LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤模型,并对模型构建的效果进行评估;其次利用所构建的小鼠乳腺炎性损伤模型,通过体内试验,研究大黄素对LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤的保护效果,并探究其作用机制;最后通过分离培养小鼠乳腺上皮细胞,在体外研究大黄素对LPS诱发的小鼠乳腺上皮细胞炎性损伤的保护作用,并探究大黄素在乳腺上皮细胞上的作用机制。为兽医临床实践中从信号转导通路着手控制炎症发生的抗炎治疗新思路提供依据,并对利用大黄素等中药天然结构化合物防治奶牛乳腺炎提供参考。首先,小鼠乳导管灌注LPS构建小鼠乳腺炎性损伤模型。将12只泌乳5~7天的母鼠随机分为空白对照组和LPS刺激组,每组6只母鼠。空白对照组小鼠不做任何处理,LPS刺激组小鼠的第四对乳头分别灌注50μL0.2mg/mL的LPS,24h后脱颈处死小鼠。肉眼观察小鼠乳腺组织的病理学变化;分别制作乳腺组织的病理学切片和MPO的免疫组化切片,观察其病理组织学的变化和MPO的分布及活性;ELISA检测小鼠乳腺组织中TNF-α的水平。结果表明,与空白对照组相比,LPS刺激组的小鼠乳腺组织出现明显的发红、肿胀、充血等病理变化;乳腺腺泡壁明显增厚、水肿,腺泡腔中出现大量嗜中性粒细胞;MPO的分布与活性明显增加;TNF-α的水平显著上升。以上指标与乳腺炎典型的病理变化完全一致,说明本实验用LPS成功构建了小鼠乳腺炎性损伤模型。其次,为研究大黄素对LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤的保护效果及作用机制,将72只泌乳5~7天的母鼠随即分为6组,包括空白对照组、LPS刺激组、LPS+大黄素低、中、高(1.0、2.0、4.0mg/kg体重)和LPS+DEX组(5.0mg/kg体重),每组含有12只母鼠。大黄素和DEX分别在LPS刺激前1h和刺激后12h腹腔注射给药。制备病理组织学切片观察乳腺的病理组织学变化;MPO免疫组化分析乳腺中MPO的分布与活性;ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达水平;RT-PCR检测TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达水平;Westernblot检测大黄素对NF-κB和MAPKs信号通路的影响。结果显示,与LPS刺激组相比,大黄素能明显减轻LPS诱导的小鼠乳腺组织的炎性损伤;减少MPO的分布,降低MPO的活性;下调了TNF-α、IL-1β和IL-6基因和蛋白表达水平;抑制了NF-κB和MAPKs信号通路的激活。以上结果证实大黄素能对LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤起到明显的保护作用,其机制是通过抑制NF-κB和MAPKs信号通路的激活来实现的。最后,为进一步验证大黄素对乳腺炎性损伤的保护效果,实验采用胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ和胰酶混合消化的方法分离培养小鼠乳腺上皮细胞,角蛋白-18免疫荧光染色鉴定其纯度,研究大黄素对LPS诱发的小鼠乳腺上皮细胞炎症损伤的保护作用及作用机制。MTT检测大黄素对小鼠乳腺上皮细胞的毒性作用;ELISA检测大黄素对LPS刺激的小鼠乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达水平的影响;Western blot检测大黄素对小鼠乳腺上皮细胞中NF-κB和MAPKs信号通路的影响。结果显示,大黄素在10、20、40μg/mL的浓度下不会对小鼠乳腺上皮细胞产生毒性作用;大黄素预处理细胞后能够明显降低TNF-α和IL-6蛋白表达水平;Western blot证实大黄素是通过抑制小鼠乳腺上皮细胞中NF-κB和MAPKs信号通路的激活而发挥其抗炎作用的。本论文通过以上实验,观察到大黄素能够对LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤起到良好的保护效果,初步证实大黄素抗炎作用机制是通过抑制NF-κB和MAPKs信号通路的激活,从而降低TNF-α、IL-6等炎性细胞因子的分泌,减少乳腺中嗜中性粒细胞浸润,减轻乳腺组织的炎性损伤,从而提示从信号转导通路着手控制炎症发生在兽医临床实践中具有一定的现实意义;同时大黄素在奶牛乳腺炎的治疗上可能有潜在的应用前景。