目的:目前非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的发病率日益增长。在发达国家,80%患有肥胖或糖尿病的成年人同时患有NAFLD^[1]。由于NAFLD与胰岛素抵抗、肥胖、血脂异常等密切相关,其被认为是代谢综合征在肝脏的临床表现^[2]。NAFLD包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎及脂肪性肝炎相关肝硬化,其可发展为肝癌^[3]。而即使是单纯性脂肪肝,目前也已经证实与心脑血管疾病有关,影响人们生存质量。因此NAFLD的防治已成为当今医学界所关注的热点。NAFLD的发病主要与过多的脂质沉积在肝脏有关。由于胰岛素抵抗,肝细胞摄入过多的自由脂肪酸（free fatty acid,FFA）致使肝细胞发生脂肪变性;随后引起的氧化应激反应、脂质过氧化及其异常细胞因子的作用致使肝小叶局部炎性变化而形成脂肪性肝炎。因此NAFLD的实质是过多脂质沉积在肝脏导致肝脏一系列的变化。目前认为自噬与肝内脂质沉积密切相关。自噬是生物体内一种相对固定的对本身进行分解代谢的过程。自噬可“自我清除”细胞内一些积累的、失效的蛋白质聚集物和有缺陷的细胞器,以保持细胞内环境的稳定性。目前认为自噬是肝细胞内脂肪降解的一种方式,脂滴是自噬的降解底物之一^[4]。自噬利用溶酶体途径,吞噬并降解脂滴,从而维持细胞内脂质代谢的平衡。研究发现在NAFLD模型中,肝内自噬活性减低,线粒体功能紊乱,并存在胰岛素抵抗以及内质网应激^[5]。在长期高脂喂养的大鼠肝脏细胞中,自噬活性减低,考虑其机制为高脂环境的长期刺激使过多的脂质沉积引起细胞功能紊乱,超出自噬的代偿代谢功能^[6]。一些外部环境压力如营养压力、氧化压力、缺氧和内在压力如细胞器损伤,蛋白聚集体,病原体感染等均可诱导产生自噬作用。上调自噬可以清除这些压力。当这些压力被清除后,自噬回复到基本水平。这些应激条件通过不同的信号途径调节自噬水平^[7,8]。而AMPK途径被认为在调控自噬作用中起重要作用^[9]。磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是一种调节细胞能量代谢的蛋白激酶。它主要的特征是能与AMP结合,通过AMP感知细胞的能量水平和代谢平衡水平来调节酶的活性。在正常细胞中,AMPK通路能抑制合成代谢通路、激活分解代谢通路,促使能源得到有效利用,提高细胞对代谢应激的适应,达到细胞生存的目的^[10]。由于AMPK途径常充当细胞内能量受体的信号,而自噬也受细胞内能量变化的影响,因此许多研究者普遍关注AMPK途径在自噬中的作用。现有研究表明,AMPK/mTOR途径可能是诱导自噬发生的重要通路^[11]。AMPK可通过激活TSC1蛋白抑制mTOR的活性,进而诱导自噬。目前,尚无理想的针对NAFLD的防治药物。在众多的干预措施中,生活方式的改变以及减轻体重仍是NAFLD干预的首选。但仍有一定的局限性,就是依从性不佳,因而需要后期药物进行干预^[12]。利拉鲁肽属于胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide 1,GLP-1）类似物,主要用于治疗糖尿病。GLP-1是人体内的肽类激素,可调节葡萄糖代谢,具有控制血糖水平,减轻体重,避免低血糖等多种效应。研究证实,肝细胞表面存在GLP-l受体（GLP-1R）,利拉鲁肽通过直接作用于GLP-1R而作用于肝脏。Armstron MJ等^[13]曾在用利拉鲁肽治疗的糖尿病患者的荟萃分析中指出,治疗26周后,患者的肝转氨酶和其它生化指标明显改善。Shvetank等^[14]提出GLP-1可通过促进自噬,抑制内质网应激,来保护肝脏免除因脂肪酸而引起的细胞凋亡,给GLP-1阻止NAFLD病人肝脂肪变性进一步恶化提供新的作用方向。本研究在体内通过高脂饮食建立NAFLD大鼠模型,随后应用利拉鲁肽干预,观察肝细胞内自噬水平的变化;在体外利用棕榈酸（palmitate,PA）诱导HepG2细胞产生脂毒性,应用利拉鲁肽干预,观察其对脂毒性肝损伤的作用及对自噬的影响;同时在体外实验中阻断AMPK通路,观察利拉鲁肽对该通路的影响和自噬的变化,旨在探讨利拉鲁肽改善脂毒性肝损伤的分子机制。本研究分如下两部分进行:第一部分:利拉鲁肽对脂毒性肝损伤自噬的影响。第二部分:利拉鲁肽通过AMPK通路对自噬的干预效应。研究方法:1.应用高脂饲料喂养法建立NAFLD大鼠模型,利用苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色进行评价。2.采用不同剂量的利拉鲁肽干预NAFLD大鼠。NAFLD大鼠模型建立后,将大鼠分为正常饲料喂养组（生理盐水日2次皮下注射）;高脂饲料喂养组（生理盐水日2次皮下注射）;低、中、高剂量利拉鲁肽干预组（分别按照50、100、200μg/kg剂量给予利拉鲁肽日2次皮下注射）,喂养4周。3.测量大鼠血生化指标。应用全自动生化分析仪测定血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerde,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）4.培养HepG2细胞。通过400μmol/L棕榈酸诱导HepG2细胞产生脂毒性。并用不同剂量的利拉鲁肽（10nmol/L、50nmol/L,100nmol/L、500nmol/L）干预。应用四甲基偶氮唑盐（Methyl thiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）检测细胞存活率。5.透射电子显微镜观察大鼠肝脏自噬小体。6.实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,real-time RT-PCR）检测大鼠肝脏组织及HepG2细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3（micro-tubule-associated protein1 light chain3,MAP1-LC3,LC3）,Beclin1蛋白以及自噬相关基因7（autophagy related gene 7,Atg7）的mRNA的表达。7.Western blot方法检测大鼠肝脏组织及HepG2细胞自噬相关蛋白LC3,Beclin1以及Atg7的蛋白表达。8.培养HepG2细胞。将细胞分为BSA组（用无血清的BSA培养基处理）,PA组（含有400μmol/L棕榈酸的培养基处理）,100G组（含有l00nmol/L利拉鲁肽的400μmol/L棕榈酸培养基处理）,以及100G+C组（10nmol/L Commpond C预先处理细胞2小时,加入含有l00nmol/L利拉鲁肽的400μmol/L棕榈酸培养基处理）,孵育24小时后收集细胞。9.应用Western blot方法检测各组自噬相关蛋白LC3,Beclin1,以及Atg7水平,以及腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）,磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）,TSC1蛋白（tuberous sclerosis-1,TSC1）,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin,mTOR）,磷酸化mTOR蛋白水平。结果:1.高脂饲料喂养12周成功建立NAFLD大鼠模型喂养大鼠12周后,分别于正常饲料喂养组（NC组）和高脂饲料喂养组（HF组）随机抽取大鼠,进行肝脏取材HE染色。显微镜下可见NC组大鼠肝细胞形态正常,肝小叶清晰,肝索排列较整齐,未见明显脂肪变的细胞及炎症浸润,HF组大鼠肝细胞细胞内充满大小不等的脂滴空泡,肝小叶紊乱,并可见炎症浸润,部分肝细胞呈气球样变;HF组大鼠NAFLD活动度评分均明显高于NC组（P<0.01）,提示NAFLD大鼠模型成功建立。2.利拉鲁肽对NAFLD大鼠肝脏组织形态学的影响利拉鲁肽干预4周后,观察各组大鼠肝脏大体形态和组织学改变。NC组大鼠肝脏呈红色,边缘锐利,HF组大鼠肝脏呈灰黄色,边缘厚,表面呈油腻感。不同浓度利拉鲁肽干预组肝脏大体表现明显改善,并随着浓度的增高肝脏形态逐渐接近NC组。HE染色结果显示利拉鲁肽治疗组脂肪空泡数量、炎症浸润和气球样变情况明显减少。3.利拉鲁肽对NAFLD大鼠的体重,血脂,血生化指标的影响喂养12周后,HF组大鼠的体重,生化指标（TG、TC、LDL-C、ALT、AST）均明显升高（P<0.01）,HDL-C明显下降;利拉鲁肽干预4周后,体重、生化指标均有明显改善。4.利拉鲁肽对棕榈酸刺激的HepG2细胞存活率、TG的影响棕榈酸可诱导HepG2细胞产生脂毒性,降低细胞存活率。利拉鲁肽干预能够增加细胞存活率（P<0.01）。同时利拉鲁肽还能降低细胞内TG水平（P<0.01）。5.利拉鲁肽对NAFLD大鼠肝脏自噬作用的影响将饲养16周的大鼠肝脏按实验方法处理后,电镜观察下显示HF组自噬小体数目明显低于NC组,而50L、100L、200L三组自噬小体的数量随着利拉鲁肽的剂量提升逐渐增多。利用Real-time PCR检测LC3-II mRNA、Beclin1 mRNA和Atg7 mRNA,Western Blot方法检测LC3蛋白、Beclin1蛋白、Atg7蛋白。结果显示HF组肝组织中LC3-II、Beclin1、Atg7 mRNA及蛋白表达显著低于NC组,差异有统计学意义（P<0.05）。利拉鲁肽干预组LC3-II、Beclin1、Atg7 mRNA及蛋白表达水平增加,50L、100L、200L组与HF组相比均有统计学意义（P<0.05）。6.利拉鲁肽对棕榈酸刺激的HepG2细胞中的自噬作用的影响应用Real-time PCR检测LC3-II mRNA、Beclin1 mRNA、Atg7 mRNA水平,Western Blot方法检测LC3蛋白、Beclin1蛋白、Atg7蛋白水平。结果发现棕榈酸组（PA组）LC3-II、Beclin1、Atg7 mRNA和蛋白表达较BSA组明显减少（P<0.01）;不同浓度的利拉鲁肽与PA共同作用24小时,10nmol/L-500nmol/L组LC3-II、Beclin1、Atg7 mRNA和蛋白的表达较PA组均升高（P<0.01）。7.AMPK通路抑制情况下利拉鲁肽对HepG2细胞自噬作用的影响400?mol/L棕榈酸组（PA组）作用于HepG2细胞24小时,LC3、Beclin1、Atg7水平与对照组（BSA组）相比有所降低（P<0.01）。在干预组（100G组）中,将400?mol/L棕榈酸与100nmol利拉鲁肽共同孵育细胞24小时,LC3、Beclin1、Atg7水平与PA组相比表现升高（P<0.01）。在含有AMPK通路抑制剂,400?mol/L棕榈酸与100nmol/L利拉鲁肽共同作用的抑制组（100G+C组）中,自噬相关蛋白LC3、Beclin1、Atg7水平与100G组相比,表达减低（P<0.01）。8.AMPK通路抑制情况下利拉鲁肽对AMPK通路相关蛋白的影响400?mol/L棕榈酸（PA组）作用于HepG2细胞24小时,p-AMPK/AMPK、TSC1、p-mTOR/mTOR水平与对照组（BSA组）相比有所降低（P<0.01）。在400?mol/L棕榈酸与100nmol/L利拉鲁肽共同孵育细胞24小时的干预组（100G组）中,p-AMPK/AMPK、TSC1、p-mTOR/mTOR水平与PA组相比表现升高（P<0.01）。在含有AMPK通路抑制剂、400?mol/L棕榈酸与100nmol/L利拉鲁肽共同作用的抑制组（100G+C组）中,p-AMPK/AMPK、TSC1、p-mTOR/mTOR水平与100G组相比,则表达减低（P<0.01）。结论:1.利拉鲁肽可在一定程度上改善脂毒性肝损伤。在高脂喂养的NAFLD大鼠中及在棕榈酸诱导HepG2细胞脂毒性作用中,自噬水平降低,利拉鲁肽干预可升高自噬水平。提示利拉鲁肽对肝的保护性作用与自噬水平升高有关。2.AMPK通路在棕榈酸诱导HepG2肝细胞脂毒性作用中被抑制,利拉鲁肽可提升AMPK水平,自噬水平也相应升高。而抑制AMPK通路,自噬水平减低,提示利拉鲁肽可能通过AMPK通路调控自噬。