宫颈癌在女性癌症发病率中高居第四位,是女性癌症主要死亡原因之一,也是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。全球每年新发病例约53万人,死亡可达27万,约85%的宫颈癌死亡人数发生在不发达国家或发展中国家,许多欠发达国家的宫颈癌3至5年生存率不足50%。流行病学研究发现,宫颈癌的发生与各型人乳头状瘤病毒(HPV)感染密切相关,96.6%的宫颈癌患者HPV DNA检测为阳性。鉴于我国宫颈癌高发病率及高死亡率的特点,发现新型诊断及治疗靶点刻不容缓。TIPE(tumor necrosis factor alpha-induced protein 8,TNFAIP8)基因家族共有4个成员:TIPE、TIPE1、TIPE2与TIPE3,各成员间具有较高的同源性,在肿瘤及炎症性疾病中发挥重要作用。TIPE1是最晚被发现的TIPE家族成员,干扰TIPE1表达可抑制凋亡和坏死性凋亡,提示其可能同时参与这两种细胞死亡的调控,是重要的细胞死亡调控蛋白。近期研究发现TIPE1作为抑癌基因参与了肝癌、胃癌及肺癌的发生发展进程。但TCGA数据库及相关文献表明TIPE1在宫颈肿瘤组织及细胞系中表达较高,特别是其高表达于含病毒DNA肿瘤细胞的现象提示TIPE1可能促进宫颈癌恶性生物学行为。本课题前期研究发现,与正常宫颈上皮永生化细胞系H8相比,TIPE1在宫颈癌细胞系中高表达;并发现TIPE1在宫颈癌肿瘤组织中较癌旁组织高表达。更重要的是,TIPE1的表达与增殖指标Ki67呈正相关,且与患者三年生存率呈负相关。以上结果提示TIPE1参与了宫颈癌疾病进程并可能促进宫颈癌恶性生物学行为。本课题在前述理论与实验基础上,通过多种分子生物学方法在体内外多水平阐明TIPE1影响宫颈癌恶性生物学行为机制,为发现TIPE家族新功能、宫颈癌治疗新靶点提供理论与实践基础。第一章绪论:TIPE基因家族在肿瘤与炎症中的作用概述TIPE(the tumor necrosis factor-alpha-induced protein 8-like,TNFAIP8L)基因家族是近年发现的调控炎症与肿瘤的基因家族,它包括四个成员:TIPE(TNFAIP8)、TIPE1(TNFAIP8L1)、TIPE2(TNFAIP8L2)和TIPE3(TNFAIP8L3)。尽管该家族在结构上具有高度同源性,但是各成员之间的生物学功能不尽相同。近年来的研究发现,该家族与肿瘤和炎症密切相关,表明它们在肿瘤及炎症性疾病中可能发挥关键生物学功能。第二章TIPE1在宫颈癌细胞系及组织中的表达2.1 TIPE1在宫颈癌细胞系中的表达本研究首先利用实时荧光定量PCR及Western Blot技术检测了正常宫颈上皮永生化细胞系H8和宫颈癌细胞系HeLa、SiHa和CaSki中TIPE1的表达情况,结果表明不管是mRNA水平还是蛋白水平,与正常宫颈上皮永生化细胞系H8相比,TIPE1在宫颈癌细胞系中高表达。2.2 TIPE1在宫颈癌组织中的表达为进一步研究TIPE1在宫颈癌组织中的表达情况,课题组用免疫组化法检测80例宫颈癌患者肿瘤组织及相邻正常组织中TIPE1的表达情况,并根据染色强度和范围进行评分,统计学方法分析其表达与增殖指标Ki67、预后的相关性。结果发现TIPE1在宫颈癌肿瘤组织中较癌旁组织高表达(P<0.01)。更重要的是,TIPE1的表达与增殖指标Ki67呈正相关(P<0.05),且与患者三年生存率呈负相关(P<0.05)。以上结果提示TIPE1参与了宫颈癌疾病进程并可能促进宫颈癌恶性生物学行为。第三章TIPE1对宫颈癌细胞增殖等生物学行为的影响3.1 TIPE1促进宫颈癌细胞增殖能力为进一步在体外验证TIPE1对宫颈癌细胞生长能力的影响,我们在两种TIPE1表达较高的宫颈癌细胞系SiHa和CaSki中利用干扰慢病毒(TIPE1-sh)对TIPE1基因进行knockdown,在HeLa细胞系中过表达TIPE1慢病毒。转染前后用CCK8法每隔24h检测其OD450值,并绘制生长曲线;PI染色法流式细胞仪检测细胞周期;BrdU法流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果显示,敲低TIPE1后显著降低宫颈癌细胞增殖速度,细胞周期分析结果显示,TIPE1敲低组S期比值减少,BrdU阳性峰比例减低。相反,当在HeLa细胞系中过表达TIPE1时,则显著增加细胞增殖并导致细胞周期S期增加。3.2 TIPE1显著增强宫颈癌细胞克隆形成能力在宫颈癌细胞系SiHa和CaSki中利用干扰慢病毒(TIPE1-sh)对TIPE1基因进行knockdown,在HeLa细胞系中过表达TIPE1慢病毒。转染24h后消化细胞并以1000个/孔的细胞密度种植于六孔板中,约10d后以0.1%结晶紫染色并拍照分析。结果显示,SiHa和CaSki干扰TIPE1后,其克隆形成能力明显降低,HeLa细胞过表达TIPE1后其克隆形成能力则明显增加。3.3裸鼠成瘤实验显示TIPE1显著增强宫颈癌细胞生长速度为进一步明确TIPE1在宫颈癌中的作用,将转染TIPE1-sh的SiHa细胞系以1*10~7的细胞密度移植到BALB/c裸鼠皮下进行成瘤实验,饲养动物至肉眼可见瘤体后,定期测量动物体重、瘤体大小,1月后处死小鼠取瘤体、称重、绘制肿瘤生长曲线并进行统计学分析。用实时荧光定量PCR及Western Blot技术检测TIPE1干扰效果,免疫组化检测TIPE1和Ki67的表达情况;结果显示TIPE1显著促进BALB/c裸鼠体内宫颈癌细胞增殖,且在TIPE1-sh转染组中Ki67的表达显著降低,表明TIPE1的表达与增殖指标Ki67正相关。第四章TIPE1促进宫颈癌恶性生物学行为的机制研究4.1基因芯片技术找到TIPE1促进宫颈癌细胞增殖的通路分子基于体内外实验中TIPE1促进宫颈癌细胞系增殖的现象,我们分析认为TIPE1可能在宫颈癌中发挥与众不同的生物学功能。HeLa细胞转染TIPE1慢病毒后,提取总RNA样品,并制备aRNA(amplified RNA)。将aRNA进行纯化,然后将其片段化后与芯片探针杂交。杂交完成后,对芯片进行洗染,最后扫描得到图片和原始数据。Affymetrix GeneChip Human Gene 2.0 ST基因芯片结果显示,过表达TIPE1的HeLa细胞p53通路分子表达明显下调,Western blotting及qPCR结果也进一步得到验证。4.2 TIPE1与野生型p53互相作用鉴于过表达TIPE1后p53通路下游分子表达下调,我们推测TIPE1可能与p53存在相互作用现象。鉴于p53在其它肿瘤中大部分是以突变体形式存在,且宫颈癌中也存在5%左右的突变型p53,因此同时构建突变型p53(R175H、R248W及R273H),Co-IP技术检测TIPE1与野生型及突变型p53互作情况。结果显示TIPE1与野生型p53存在互作,但与突变型p53互作能力明显减弱。该现象可以部分解释TIPE1在宫颈癌中表现为癌基因,而在其它肿瘤中为抑癌基因的原因。4.3 TIPE1影响p53乙酰化水平我们发现不管是过表达抑或干扰TIPE1后,总p53水平无明显变化,有趣的是p53乙酰化水平变化明显。该现象高度提示TIPE1可能通过与p53结合影响其表观修饰,进而影响p53通路下游蛋白,最终促进宫颈癌恶性生物学行为。4.4 TIPE1以p53依赖方式促进宫颈癌细胞增殖应用shRNA技术敲低p53基因,在SiHa和CaSki细胞中干扰TIPE1后观察其促进宫颈癌细胞增殖作用是否仍然存在,结果显示当敲低p53基因后TIPE1促进宫颈癌增殖、克隆形成等作用明显降低,提示p53信号通路在TIPE1促进宫颈癌恶性生物学行为的作用中扮演“执行者”的角色。4.5 p53蛋白反式促进TIPE1表达利用Position Weight Matrices(PWM)软件预测到TIPE1启动子区11295到11304位点有一个p53反应元件(response elements,REs)。Chip-PCR及荧光素酶报告基因实验显示p53可以结合位于TIPE1启动子区的p53RE序列,在Dox(阿霉素)诱导下可显著增强TIPE1转录活性。该结果提示p53-TIPE1可形成负反馈调控环路。第五章TIPE1抑制宫颈癌耐药细胞株对顺铂(CDDP)诱导凋亡的机制研究5.1宫颈癌耐药细胞株及组织标本中TIPE1及MDR1表达上调由于p53蛋白与凋亡密切相关,因此我们拟探讨TIPE1在宫颈癌耐药及CDDP诱导宫颈癌细胞凋亡的相关机制。首先成功建立宫颈癌CDDP耐药细胞株(SiHa/CDDP,HeLa/CDDP),CCK8法验证耐药株IC50值较母本细胞明显升高。qPCR及western blot实验发现耐药细胞株中TIPE1及MDR1(多药耐药基因1)表达上调,同时免疫组化发现CDDP耐药宫颈癌病人组织中TIPE1表达也上调,与MDR1表达正相关,且与预后相关。以上结果初步提示TIPE1可能参与并促进了宫颈癌耐药过程。5.2 TIPE1抑制宫颈癌耐药细胞株对CDDP诱导的凋亡转染TIPE1干扰慢病毒后,宫颈癌耐药细胞株SiHa/CDDP和HeLa/CDDP IC50值(肿瘤细胞半数致死量)下调,同时流式细胞仪检测发现干扰TIPE1后SiHa/CDDP和HeLa/CDDP细胞株在CDDP诱导下凋亡增多。以上结果表明TIPE1可抑制宫颈癌耐药细胞株CDDP诱导下的凋亡。5.3裸鼠成瘤实验表明TIPE1抑制宫颈癌耐药细胞株对CDDP诱导的凋亡为进一步明确TIPE1在宫颈癌耐药细胞株中的作用,将转染TIPE1-sh及对照病毒的SiHa/CDDP耐药细胞株以1*10~7的细胞密度移植到BALB/c裸鼠皮下进行成瘤实验,饲养动物至肉眼可见瘤体后。随机分成四组:对照病毒组、TIPE1-sh组、对照病毒+CDDP组和TIPE1-sh+CDDP组,CDDP用量30μg/kg,其中两组CDDP组进行腹腔注射CDDP,每隔3d注射一次共四次。每2d测定一次肿瘤的长径(a)和宽径(b),并计算瘤体体积v=a×b~2/2,绘制肿瘤的生长曲线并进行统计学分析。免疫组化检测TIPE1和MDR1的表达情况及细胞凋亡情况;Tunel法检测凋亡情况。结果显示TIPE1明显抑制CDDP诱导的宫颈癌细胞凋亡,且TIPE1的表达与多药耐药基因MDR1表达正相关,表明TIPE1通过促进MDR1表达进而抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。5.4 TIPE1通过抑制野生型p53促进多药耐药基因MDR1表达由于课题组前期实验发现TIPE1可以和野生型p53互作并影响其活性,但是与突变型p53互相之作用明显减弱,野生型p53可通过反式调节降低多药耐药基因1(MDR1)启动子活性,从而提高化疗药物的敏感性。因此我们推测TIPE1是否也通过抑制野生型p53活性,从而促进宫颈癌耐药发生。结果显示干扰p53表达后再次转染TIPE1干扰慢病毒,SiHa细胞对CDDP诱导凋亡部分消除。有意思的是,我们在p53野生型宫颈癌细胞系SiHa及p53突变型宫颈癌细胞系C33A中共转染TIPE1及MDR1启动子区质粒,双荧光素酶实验发现在有野生型p53存在的SiHa细胞中TIPE1可以激活MDR1启动子活性,而在突变型p53存在的C33A细胞中TIPE1的作用消失。同时,在CDDP诱导下,过表达TIPE1可以促进携有野生型p53的SiHa细胞MDR1表达,但在携有突变型p53的C33A细胞中TIPE1该功能消失。以上结果表明TIPE1通过抑制野生型p53活性参与宫颈癌耐药机制发生。综上所述,本课题通过一系列体内外实验,首次证明TIPE1以癌基因功能影响宫颈癌恶性生物学行为。在宫颈癌组织标本中,我们发现表达较高的TIPE1水平与病人预后负相关;细胞及裸鼠成瘤实验表明TIPE1可促进宫颈癌增殖;通过基因芯片发现TIPE1可能通过p53途径影响宫颈癌生物学功能。分子生物学实验进一步提示TIPE1通过与野生型p53互作,导致其乙酰化水平降低,从而发挥癌基因功能。TIPE1以野生型p53依赖方式促进宫颈癌细胞增殖及抑制CDDP诱导的宫颈癌细胞凋亡,说明p53通路在TIPE1行使癌基因功能中发挥至关重要的作用。P53对TIPE1的反式激活作用表明两者之间的作用方式更为复杂和紧密。本实验的完成,将明确宫颈癌中TIPE1表达上调对宫颈癌恶性生物学行为影响的机制和重要参与分子;为候选宫颈癌恶性生物学行为标志物及其治疗靶点提供基础研究数据;同时,发现与p53作用的新型分子及其作用机制。也将对揭示宫颈癌发病机制、发现新型治疗靶点具有一定的理论与实践意义。