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小肽转运载体1(Oligopeptide transporter 1,PepT1)是位于肠上皮细胞刷状缘膜囊内的一种转运蛋白,能将二肽和三肽从细胞外转运到细胞内,在肠道小肽的吸收过程中起着关键作用。本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的酪氨酸激酶2(Janus Kinase 2,JAK2)基因,并通过体内和体外实验,研究了瘦素(Leptin,LP)通过JAK2对草鱼肠道PepT1基因表达的调控作用,初步揭示了瘦素对草鱼肠道PepT1基因的表达的调控机理。1)草鱼JAK2基因克隆、表达及其对PepT1基因活性的调控利用PCR技术克隆了草鱼肠道JAK2基因的cDNA序列,其长度为3676 bp,共编码1126个氨基酸,分子量和等电点分别为129590.26 Da和6.37。系统进化分析表明JAK2基因在进化上比较保守,其中与鲤科鱼类同源基因亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测JAK2基因在草鱼各组织中的表达,发现在肾脏、垂体、肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肠道中均有表达,其中肠道中表达量最高,与其他组织有显著性差异(P<0.05)。在胚胎发育过程中,从受精卵开始,JAK2在发育过程中各阶段均有表达,原肠期阶段表达量最高(P<0.05)。通过双荧光素酶报告基因实验,发现草鱼JAK2过表达能够显著上调PepT1 5’端调控序列活性(P<0.05),初步揭示了草鱼JAK2可能对PepT1基因具有调控作用。2)瘦素对草鱼肠道JAK2和PepT1基因表达水平的影响体内(注射)实验:本研究分别利用0.016μg/g、0.16μg/g、1.6μg/g、16μg/g和160μg/g浓度的瘦素对草鱼进行活体腹腔注射实验,8 h后取肠道通过RT-qPCR检测JAK2和PepT1基因表达,结果显示:JAK2和PepT1基因的mRNA表达量均随注射瘦素浓度的增加先升高后下降,并在0.16μg/g瘦素组达到最大值(P<0.05)。随即参照上述实验方案进行JAK2特异性抑制剂AG490注射实验。结果发现,与对照组相比,瘦素能够显著诱导草鱼肠道PepT1基因表达水平(P<0.05),但这种诱导作用能够被JAK2特异抑制剂显著减弱(P<0.05),暗示了草鱼JAK2可能参与了瘦素对肠道PepT1表达调控过程。体外(细胞)实验:本研究利用组织块法建立了草鱼肠道上皮细胞原代培养技术,并通过细胞角蛋白8、E-钙黏蛋白和紧密连接蛋白ZO-1三种特异性抗体对其进行了进行鉴定。通过在培养的草鱼肠道上皮细胞中分别加入含有不同浓度草鱼重组瘦素(0、50、100、250、500和1000 ng/mL)发现,与对照组相比,肠道细胞中JAK2基因的mRNA表达水平在50和100 ng/m L瘦素组显著上调(P<0.05),PepT1基因则在100 ng/mL瘦素组最高(P<0.05)。随即参照上述实验方案利用JAK2特异性抑制剂处理肠道细胞,结果发现添加瘦素组细胞PepT1基因表达水平显著高于对照组(P<0.05),而添加瘦素+AG490组基因表达水平显著低于瘦素组(P<0.05),这些结果进一步证明JAK2在瘦素调控草鱼肠道PepT1基因表达过程中发挥着重要的作用。