论文部分内容阅读
化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes,T.pyogenes）为革兰氏阳性条件性致病菌,它能够引起动物和人的各种化脓性疾病,包括心内膜炎、肝脓肿和呼吸道感染等。由化脓隐秘杆菌引起的动物感染给农业经济造成较大的损失。TatD蛋白（twin-arginine protein translocase protein D）是一种广泛存在于多种生物的核酸酶,可以参与病原体的免疫逃避机制,并直接影响其致病力。但尚未见有关化脓隐秘杆菌TatD功能及其抑制剂的相关研究报道。本课题组前期研究发现,黄酮类化合物木犀草素对化脓隐秘杆菌具有良好的抗菌作用,且能抑制拓扑异构酶、转座酶等酶类的活性。本研究将探究TatD蛋白在化脓隐秘杆菌中的功能,验证其是否与细菌毒力相关;并以木犀草素为候选抑制剂,分析其对TatD DNases活性的影响,以期为抗细菌毒力策略的新型抗菌药物的研发提供指导。本研究通过对化脓隐秘杆菌TatD蛋白的生物信息进行预测与分析,确定了在化脓隐秘杆菌共携带两个TatD蛋白,分别为TatD960和TatD825。它们只具有一个磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase,TIM）-桶状结构域,且无信号肽与跨膜域。应用PCR对20株化脓隐秘杆菌进行tat D960和tat D825基因的检测,检出率均为100%。采用原核表达方法获得TatD960和TatD825的重组蛋白,并检测了二者对DNA的水解活性,验证TatD蛋白的生化功能;制备TatD蛋白的多克隆抗体,以Western blot检测了细菌TatD蛋白分布的位置。结果表明,TatD960和TatD825蛋白均具有Mg2+依赖的DNase活性,并且在化脓隐秘杆菌的细胞内表达。为进一步分析化脓隐秘杆菌TatD蛋白的功能,本研究采用同源重组的方式构建了化脓隐秘杆菌tat D基因缺失株（BMH06-3Δtat D960、BMH06-3Δtat D825、BMH06-3Δtat D960Δtat D825）,并比较它们与野生株的生长能力、溶血活性、药物敏感性、致病力及生物被膜形成能力等的差别。结果显示,基因缺失菌株的生长能力、溶血活性及药物敏感性均未发生变化;而对小鼠的致病性低于野生株（p=0.0022）。感染双tat D缺失株（BMH06-3Δtat D960Δtat D825）的小鼠的脾脏载菌量显著低于接种单tat D缺失株（BMH06-3Δtat D960、BMH06-3Δtat D825）及野生株的小鼠（p＜0.01）。此外,基因缺失株的生物被膜形成能力、胞外DNA（extracellular DNA,e DNA）释放水平及自溶能力与野生株相比,均显著下降（p＜0.01）。为探究木犀草素是否可作为TatD DNases的抑制剂并干扰它们的表达,本研究分别应用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）和Western blot方法测定了木犀草素作用前后化脓隐秘杆菌tat D基因的m RNA表达量和蛋白表达量,分析木犀草素对tat D基因表达水平的影响。试验结果显示,亚抑菌浓度（1/2 MIC）的木犀草素作用化脓隐秘杆菌后,分别有85%和80%的菌株的tat D960和tat D825基因转录水平下调;有90%和85%的菌株的TatD960和TatD825蛋白表达水平下调,表明木犀草素能够抑制化脓隐秘杆菌tat D基因的表达。为考察木犀草素对TatD DNases功能的影响,本试验采用琼脂糖凝胶电泳试验检测了TatD DNases水解DNA的能力,分析了不同浓度木犀草素对TatD DNases活性的作用。研究显示,木犀草素可抑制TatD DNases的酶活性,且抑制能力呈现剂量依赖性。运用SWISS-MODEL在线软件对TatD蛋白三级结构进行模拟,同时通过分子对接技术分析木犀草素对TatD蛋白的作用位点。研究显示,木犀草素与TatD蛋白之间主要以氢键结合,并可分别作用于TatD960的关键残基His106和TatD825的关键残基His164、Asp212。应用表面等离子体共振（surface plasmon resonance,SPR）技术检测了木犀草素与TatD蛋白分子间的相互作用。结果表明,木犀草素与TatD960、TatD825的亲和力分别为2.272×10-4 M、1.816×10-4 M,均属于中等强度的结合;且木犀草素可与两蛋白进行动力学拟合,药物与TatD960的结合与解离常数分别为395.8 1/Ms和0.0025 1/s,与TatD825的结合与解离常数分别为369.1 1/Ms和0.0021 1/s,呈现快结合、慢解离的互作形式。综上所述,本研究发现化脓隐秘杆菌TatD蛋白是一种Mg2+依赖的DNA内切酶,并能影响细菌毒力和参与生物被膜的形成;木犀草素能够抑制大多数化脓隐秘杆菌tat D基因的表达;木犀草素可与TatD DNases发生稳定的特异性结合并抑制其活性。本研究将为以TatD蛋白为靶标的新型抗菌药物的研发提供新的思路,也将为木犀草素的进一步开发利用奠定了坚实的理论基础。