研究背景随着物质生活水平的提高和现代生活方式的影响,非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic Fatty Liver disease,NAFLD)的发病率和患病人口数量激增,已成为全球第一大非感染性肝病。美国等西方国家发病率为20-33%,我国成年人发病率约12-15%。肥胖和胰岛素抵抗是造成NAFLD快速攀升的重要因素。NAFLD疾病谱包括非酒精性单纯脂肪肝(Non-alcoholicfatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic Hepatitis,NASH)及其相关肝纤维化、肝硬化,少数可进展为肝癌。NASH是单纯脂肪肝向肝纤维化及肝硬化发展的重要阶段,以肝细胞脂肪变性、炎细胞浸润和肝小叶纤维化为特征。NASH的发病机制以“二次打击”学说广为接受,即胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)和细胞氧化应激等损伤因素。但临床上针对上述发病机制所使用的胰岛素增敏剂、抗氧化剂及其联合用药,并不能完全阻断NASH的进展,其根本原因是对NASH的关键发病机制并不清楚。近年研究显示,炎症免疫在NASH发病中有重要作用。Th17细胞是免疫调节的重要成分,通过抑制调节性T细胞(Tregs)的功能,分泌IL-17A等细胞因子,激活枯否细胞,诱导Th1细胞极化,参与多种肝脏疾病的发生。在多种炎症性肝病,如病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、酒精性肝病和NASH患者的外周血及肝组织中发现Th17细胞数量及IL-17A表达水平显著升高。在LPS诱导的急性肝损伤及NASH动物模型中也发现IL-17A的水平升高,并与肝损伤程度显著正相关。IL-17A或其特异受体IL-17RA的基因敲除能显著减轻高脂诱导小鼠NASH的进展。采用IL-17A抗体中和内源性IL-17A能有效减轻LPS诱导的肝损伤。但IL-17A基因敲除如何减轻肝损伤的机制并未阐明。本研究以IL-17A基因敲除小鼠为对象,通过高脂膳食诱导脂肪肝,并给予低剂量LPS刺激诱导肝损伤为模型,观察IL-17A基因缺失在脂肪肝小鼠肝损伤中的作用和机制。本研究旨在为临床上以肝脂肪变性为基础的炎性损伤机制提供理论依据。研究方法(1)脂肪性肝炎症损伤小鼠模型的建立:以基因敲除(KO)IL-17A(IL-17A-/-)小鼠为工具,采用6个月长程高脂饮食(HF)辅助一次性LPS(4mg/kg体重)刺激模拟急性炎症刺激诱导脂肪肝炎症性损伤,以普通饲料组(Chow)小鼠为对照。动物共分四组:野生型(WT)正常膳食组(n=7),野生型高脂膳食+LPS组(n=7),IL-17A KO正常膳食组(n=7),IL-17A KO高脂膳食+LPS组(n=7)。(2)IL-17A-/-敲除小鼠鉴定:方法一:剪尾,提取基因组DNA,PCR扩增鉴定基因敲除小鼠中特有的载体DNA片段;方法二:酶联免疫吸附(ELISA)法检测血浆IL-17A水平。(3)小鼠生长发育体征及摄食量的检测:测定小鼠体重、体长、尾长、摄食量的测定。(4)小鼠肝脏及血液生化代谢指标的检测:血浆甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸含量测定。(5)小鼠肝损伤的评估:测定血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶,TUNEL法检测了肝脏实质细胞的凋亡情况,HE染色观察肝脏组织形态。(6)血浆和肝脏炎症因子的检测:ELISA测定血浆和肝脏TNF-α、IL-6和IL-1β水平测定。(7)小鼠肝脏转录组学分析:每组小鼠选取3只,4组动物,共12个样品,Trizol法提取肝脏总RNA,全基因表达谱芯片分析交由上海康成生物有限公司进行。(8)小鼠肝脏蛋白组学分析:每组小鼠选取3只,4组动物,采用iTRAQ技术对4组小鼠肝脏的蛋白质表达谱及其含量进行相对定量及分析,此部分交由深圳华大科技有限公司进行分析。研究结果(1)IL-17A基因敲除不影响小鼠的一般发育情况,小鼠的体重、体长、尾长及摄食量正常膳食及高脂膳食喂养条件均无显著差别。(2)6个月高脂膳食喂养后,小鼠肝脏脂肪变性严重高于正常饮食小鼠,小鼠血浆甘油三酯,总胆固醇和游离脂肪酸测定结果显示:与Chow小鼠相比较,HF小鼠血浆的甘油三酯、总胆固醇水平均显著升高,游离脂肪酸的含量则无明显差异;KO小鼠进食Chow或HF,两组小鼠的血浆代谢指标均无显著差异。给予脂肪肝小鼠急性LPS刺激(HF+LPS),相比较于WT小鼠,IL-17A-/-基因敲除显著降低小鼠血浆谷草转氨酶(p<0.05)和谷丙转氨酶(p<0.05)水平,肝脏炎症细胞浸润显著减少,肝脏和血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著降低。TUNEL法检测肝脏实质细胞凋亡情况,结果显示:IL-17A-/-小鼠肝脏中凋亡细胞数量较野生型小鼠显著减少(p<0.001)。肝脏转录组学分析显示:HF+LPS刺激下,两组小鼠间共有938个基因被显著影响,而这部分基因主要富集于Oxidation Reduction Process(p=0.00017),Hydrogen Peroxide Metabolic Process(p=0.0026),Glutathione Metabolic Process(p=0.0048)。肝脏蛋白质学分析显示:在该刺激条件下,差异蛋白质分子主要富集于Response to oxidative stress(p<=0.0361),Response to reactive oxygen species(p=0.0047),Response to hydrogen peroxide(p=0.0165),与转录组结果一致。(5)q PCR验证肝脏过氧化氢代谢转化相关酶的mRNA表达水平表明:HF+LPS刺激下,IL-17A-/-小鼠肝脏中CAT(p<0.05)、GPX1(p<0.05)、IDH1(p<0.05)、IDH2(p<0.05)以及ME1(p<0.05)mRNA表达水平明显高于WT小鼠;IL-17A KO小鼠肝脏CAT酶活性(p<0.001)和NADPH含量(p<0.01)显著高于WT小鼠;肝脏MDA含量较WT小鼠显著减少(p<0.001),总抗氧化水平T-AOC显著高于WT小鼠(p<0.05)。(6)免疫组化显示在HF+LPS刺激下,肝脏中抗氧化应激关键转录因子NRF2的细胞核定位显著高于WT小鼠。(7)转录组和蛋白质组中趋化因子及配体的表达情况还显示,KO小鼠在HF+LPS刺激下有24种趋化因子的mRNA表达发生显著变化,这些趋化因子主要参与中性粒细胞、单核细胞和Th1细胞的趋化。此外,对蛋白质组差异蛋白质的分析还发现:与M2型巨噬细胞分化、细胞凋亡以及氧化应激相关的蛋白质分子表达与WT小鼠存在显著差异。结论(1)在HF+LPS刺激下,IL-17A基因敲除显著减轻LPS诱导的脂肪肝小鼠炎症性损伤;(2)在HF+LPS刺激下,IL-17A基因敲除显著增强肝脏过氧化氢代谢转化能力,减轻小鼠肝脏氧化应激损害;(3)在HF+LPS刺激下,IL-17A基因敲除显著增加肝脏NRF2转核,从而显著上调过氧化氢清除相关酶的mRNA表达水平;(4)在HF+LPS刺激下,IL-17A基因敲除还可能通过减少对中性粒细胞、单核细胞和Th1细胞趋化以及促进肝脏巨噬细胞向M2型分化来减轻LPS诱导的脂肪肝小鼠炎症性肝损伤。